树突状细胞在实验性矽肺发生发展中的作用与机制

Pneumoconiosis is still a serious harmful occupational disease. Although its mechnism is not clear, it is confirmed that the immune response is the key in occurance and development of pneumoconiosis. In the past, it was limited to observe the effective cell in disscusing the immune mechnism of silicosis. It was lack to study systemly the role of dendritic cell in antigen presenting, immune response and immune tolerance. So for our research, we decide to establish a experimental silicosis rat model, carry out vitro experiment and population epidemiological survey. Use immunohistochemical, cell co-culture, flow cytometry, electronic microscope and confocal microscope to observe the effect and mechnism of dendritic cell in recognition and phagocytosisof the silic dust, silicosis antigen presenting, the promote and function control of silicosis acquired immune response, silicosis Th1 / Th2 cytokines reaction, silicosis immune tolerance and negative phase control. The objective is to explore immunological mechanism of pneumoconiosis and search for biomarkers and key target of pneumoconiosis. It is very immportant valueful to study the pneumoconiosis mechanism, look for effective index of monitoring and early detection, and provide new ideas and theoretical basis for immune intervention of pneumoconiosis.

矽肺危害严重，机制虽不清楚，但已知其发生发展过程的关键环节之一是免疫反应。以往探讨矽肺免疫机制观察效应细胞较局限，尚未系统研究抗原递呈作用最强并能启动免疫应答、维持免疫耐受的树突状细胞的作用与机制。拟构建实验性矽肺大鼠模型，辅以体外实验模型和人群流行病学调查，采用免疫组化、细胞共培养、流式细胞术、电子显微镜观察、激光共聚焦显微镜观察等技术，系统研究树突状细胞在矽尘识别与摄取、矽肺抗原递呈、矽肺获得性免疫应答触发与功能调控、矽肺Th1/Th2细胞因子反应、矽肺免疫耐受与负相调控中的效应与机制，深化对矽肺发生发展的免疫学机制的认识，探讨潜在的尘肺生物标志和关键靶点，为全面揭示尘肺病机制、研制尘肺监测与早期发现的有效指标，并为进一步开展尘肺病的免疫干预研究提供新的思路和理论依据。

目的 构建实验性矽肺大鼠模型，辅以体外实验模型和人群流行病学调查，系统研究树突状细胞（dendritic cell，DC）在SiO2粉尘识别与摄取、矽肺炎症与纤维化形成、调节矽肺免疫反应等方面的作用与机制。方法 原代培养外周血来源的DC及肺泡巨噬细胞、脾脏淋巴细胞，建立体外共培养模型，观察DC吞噬SiO2粉尘功能及其表型、形态变化，检测SiO2粉尘对DC成熟度、分泌细胞因子、NFκB信号通路和活化、分化T细胞功能的影响。非气管暴露滴注SiO2粉尘构建矽肺大鼠模型，分别在1周、2周、3周、6周、12周取肺泡灌洗液、外周血和肺组织标本，观察肺泡内DC对SiO2粉尘的吞噬，检测DC、AM、Th1、Th2细胞数量、比例分布规律，检测肺组织中Th1、Th2型细胞因子的表达变化，双向电泳技术筛选矽肺大鼠肺组织特异性表达蛋白，噬菌体单链抗体库技术筛选和鉴定矽肺特异性抗体。采集部分矽肺患者和观察对象外周血和肺泡灌洗液，初步检测其DC、Th1、Th2细胞数量及活化T细胞数量分布。结果 体外将培养的大鼠外周血单核细胞诱导成DC，电镜观察到DC以胞吞形式吞噬SiO2粉尘。发现SiO2粉尘抑制DC成熟，致其形态、吞噬功能、细胞因子分泌功能、分化T细胞作用和TLRs/Myd88/NFκB信号转导通路改变。大鼠矽肺发生发展过程中DC可从外周血向肺部迁移。随着染尘时间延长，大鼠外周血、肺组织、肺泡灌洗液中DC数量逐渐增多，3周时达最高；电镜下可见大鼠肺泡内DC吞噬有SiO2粉尘；肺泡灌洗液中 Th1/Th2细胞数量比值、肺组织中Th1/Th2细胞因子比值逐渐降低。通过双向电泳技术获得了重复性和分辨率较好的矽肺大鼠差异表达蛋白6种，利用噬菌体展示技术筛选并初步鉴定出与尘肺的发生密切相关的3个特异性单链抗体。通过人群流行病学研究初步观察到尘肺病人体内存在DC、Th1 和活化T细胞数量的变化。结论 DC在体外和体内都具有直接吞噬SiO2粉尘的作用。大鼠于暴露SiO2粉尘后，DC由外周血向肺部迁移，可通过吞噬SiO2粉尘、表型改变、活化T细胞、调节Th1/Th2平衡等功能和机制，参与实验性矽肺的发生发展，尤其是在炎症反应期作用较为显著。