皮蝇素A转基因动物模型制备及其在异种器官移植中应用

皮蝇素A(HyderminA，HA)是牛皮蝇一期幼虫分泌的丝蛋白酶，作用于宿主免疫系统，使幼虫在宿主体内产生"免疫逃避"。异种移植器官表达分泌HA，使其"寄生虫化"，能否抑制宿主对其产生各种免疫排斥反应，延长存活时间，以及HA与宿主补体系统作用机制是本项目研究目的。因此，本项目以皮蝇素A基因cDNA序列为目的基因，构建分泌型真核表达载体，采用显微注射方法，制备转基因动物模型。通过测定比较模型鼠、野生型鼠正常状态和抗原刺激后血浆中各种补体成份变化，研究HA与补体系统作用机制。用模型鼠心脏人血清再灌注、心脏异种异位移植、皮肤异种移植、新生模型鼠卵巢异种异位移植研究移植器官分泌HA能否通过抑制宿主补体系统激活抑制超急性、血管性急性、细胞性急性、慢性排斥反应。为研究解决异种器官移植排斥反应提供了新方法、新思路。

皮蝇素A(HyderminA，HA)作为一种丝氨酸蛋白酶，能降解补体，抑制免疫排斥反应，在器官移植中具有重要作用。本项目构建了HA的分泌性真核表达载体，在细胞水平上研究HA对补体C3的作用；研究结果显示，HA能降解补体C3，EMSA实验进一步研究证实HA 通过主链结合位点与C3相互作用。制备了HA的转基因小鼠，HA转基因小鼠血清中C3含量显著低于阴性对照组；皮肤移植实验研究显示，HA转基因小鼠皮肤在2d、4d与8d中的炎性细胞数显著低于阴性对照组小鼠皮肤；ELSIA测定了HA转基因小鼠皮肤与阴性对照组皮肤中C3与C9含量，结果显示HA转基因小鼠移植皮肤中C3与C9含量显著低于阴性对照组移植皮肤；同时通过western blot测定了HA转基因小鼠移植皮肤与阴性对照组中的C3、C9、CD4, B7-2 与 MHC class II表达变化，结果显示，C3、C9、CD4, B7-2 与 MHC class II在2d、4d与8d中HA转基因小鼠移植皮肤表达含量显著或极显著低于阴性对照；检测了移植皮肤的生存率，在4d、8d及20d，HA转基因鼠移植皮肤的成活率显著高于对照组。同时探索了HA对前列腺素（PGE2）及各种多种细胞因子表达的影响，结果显示HA可以通过诱导PGE2的表达并进一步通过前列腺素受体（EP1-4）调控细胞因子的表达，进而诱导免疫抑制。本研究为器官移植中降低免疫排斥反应及延长生存率提供理论基础。