骨髓间充质干细胞促进扩张皮肤新生的机制及基因干预研究

Skin and soft tissue expansion therapy is widely used in plastic surgery, with an obvioius shortcoming of long-time expansion, due to the relatively slow proliferation of dermal fibroblasts and insufficient collagen secretion. Surported by a previous Small Exploration Project, we discovered that 17 percents of the new cells in the expanded skin were bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs). Moreover, BM-MSCs can secrete PEDF, which can enhance the proliferation and migration of fibroblasts and wound healing. Therefore, we assumed that in the expanded skin BM-MSCs paracrine PEDF, promoting dermal fibroblasts proliferation. Based on the in vitro cell co-culture model and in vivo skin expansion model, via overexpressing PEDF by adenovirus and blocking PEDF expression by siRNA, we will investigate whether PEDF has an important effect on the process of skin expansion promoted by BM-MSCs and the mechanisms involved, which will provide a critical molecular target and theoretical basis for stem cell therapy in skin and soft tissue expansion.

皮肤软组织扩张术是整形外科最常用修复方法之一，但目前仍存在扩张时间较长的突出缺点，主要由于真皮成纤维细胞增殖较慢，细胞外基质合成速度慢，生物性生长产生新生皮肤速度较慢。本课题组前期在小额探索项目资助下，证实了扩张皮肤中约17%新生细胞来源于骨髓间充质干细胞（BM-MSCs），进一步筛查发现BM-MSCs可分泌大量色素上皮衍生因子（PEDF），PEDF可显著促进成纤维细胞增殖及移行，促伤口愈合，故我们推测：BM-MSCs在扩张皮肤局部通过旁分泌PEDF，促进真皮成纤维增殖。本研究拟利用腺病毒过表达及siRNA阻断BM-MSCs中PEDF表达，利用体外真皮成纤维细胞与BM-MSCs共培养模型及小鼠背部皮肤扩张模型，探索PEDF在BM-MSCs促进真皮成纤维细胞增殖及皮肤扩张过程中是否发挥重要作用及相关机制，为采用基因干预手段提高皮肤软组织扩张干细胞治疗效果提供分子靶点和理论依据。

皮肤软组织扩张术是整形外科最常用的修复方法之一，但是为了获取足够的皮肤用于修复缺损部位，一般需要长达数月的时间进行扩张，给患者的生活带来诸多不便，成为临床应用过程中最突出的缺点。课题组采用自行改良设计的短注射导管枕型扩张器构建小鼠皮肤软组织扩张模型，在扩张的第1周至第4周分别取材，检测扩张皮肤中PEDF表达情况，结果发现随着扩张时间延长，PEDF表达水平明显升高。同时我们对临床上收集的扩张皮肤标本进行芯片分析，发现PEDF表达水平较正常皮肤升高，这与我们前期对扩张皮肤进行免疫荧光染色结果相似。.PEDF在扩张后的皮肤真皮成纤维中未发现表达，说明在扩张条件下PEDF对表皮的影响较为明显。.在研究过程中，我们考虑到皮肤扩张是一个多种因素参与的过程，如局部皮肤受到缺氧、机械牵拉、炎症环境等多种因素的影响，导致皮肤表皮和真皮的微环境改变进而调控不同的细胞生长因子，最终不能明确其影响扩张皮肤增殖缓慢的机制。为了进一步明确PEDF对扩张皮肤中的作用，我们将扩张的因素分成缺氧和机械应力牵拉两部分。将表皮细胞（HaCat）分别在常氧（21%）和缺氧（1%）条件下进行培养，发现缺氧条件下PEDF基因水平和蛋白水平表达明显升高，细胞增殖缓慢。同时，在缺氧条件下大量细胞滞留在S期，表皮细胞的迁移能力明显减弱，PEDF合成和分泌能力减弱。而缺氧条件下真皮成纤维细胞中PEDF的表达没有影响，这与临床样本的PEDF免疫荧光染色结果较为一致。.为了进一步研究PEDF对表皮细胞的作用机制，我们利用慢病毒系统过表达PEDF及siRNA阻断表皮细胞中PEDF的表达，结果表明过表达PEDF的表皮细胞增殖速度缓慢，并且细胞迁移缓慢。同时细胞分泌出的PEDF水平也有明显改变，将其上清收集后培养成纤维细胞和血管内皮细胞，发现能改变细胞中PEDF和VEGF的表达。后期研究我们将持续关注旁分泌对成纤维细胞和血管内皮细胞的生物学行为的影响。.这些研究结果表明PEDF参与扩张皮肤的增殖，表皮细胞合成的PEDF通过旁分泌作用影响真皮成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖，为采用基因干预手段提高皮肤软组织扩张治疗效果提供分子靶点和理论依据。