基于GLP-2信号通路研究高直链淀粉日粮促进羔羊小肠上皮生长的分子机制

The intestinal growth and development of young ruminant is critical for their health and performance. Previous studies found that high-amylose diet promoted the growth of intestinal epithelium in lamb, but the exact molecular mechanism is unclear. Thus, through the use of flow cytometry, real-time quantitative PCR, western blot and immunofluorescence technology, this project was to (1) study the effect of the high-amylose diet on small intestinal epithelial cell proliferation and proliferation-related genes and protein expression in lamb; (2) investigate the effect of the high-amylose diet on mRNA and protein expression levels of GLP-2 and GLP-2R in small intestinal tissue of lamb; and (3) explore the relationship between intestinal epithelial cell proliferation and secretion of endogenous GLP-2. Furthermore, an intestinal primary cell culture experiment was designed to explore the role of IGF-1/PI3K/AKT signaling pathway in GLP-2 promoting intestinal epithelial cell proliferation. These results will help reveal the molecular mechanism of high-amylose diet promoting growth of intestinal epithelium and provide new insight into the development of nutritional regulation strategy of lamb.

幼龄反刍动物小肠的生长发育状况对保证动物健康及提高动物生产性能至关重要。前期研究发现，高直链淀粉日粮可促进羔羊小肠上皮生长，但其确切机制尚不清楚。本项目拟在此基础上，利用流式细胞计数、实时定量PCR、western blot及免疫荧光等技术手段，研究高直链淀粉日粮对羔羊小肠上皮细胞增殖及增殖相关基因和蛋白表达的影响，解析高直链淀粉日粮对小肠组织中GLP-2及GLP-2R的mRNA及蛋白表达水平的影响，探讨小肠上皮细胞增殖与GLP-2生成间的内在关联。在此基础上，采用肠原代细胞培养，研究IGF-1/PI3K/AKT信号通路在GLP-2调节小肠上皮细胞增殖中的作用机制。项目结果有助于揭示高直链淀粉日粮促进羔羊小肠上皮生长的分子机制，并可为羔羊营养调控策略的制订提供新思路。

小肠是幼龄反刍动物消化、吸收营养的功能器官，同时也是动物机体中重要的免疫器官。但是，在反刍动物中，由于瘤胃更为主要的消化吸收功能，较多研究关注瘤胃的生长发育状态，而对小肠生长发育的关注相对较少。基于此，寻求有效的营养调控手段促进幼龄反刍动物小肠的生长发育，对保证其肠道健康及提高动物生产性能具有重要意义。试验1旨在研究不同淀粉来源开食料对断奶前羔羊生产性能、小肠上皮形态结构、细胞增殖、GLP-2分泌的影响。试验选取24只体况良好、胎次一致、体重相近的初生羔羊（湖羊），在10日龄时，将其随机分为3组，在饲喂相同母乳的基础上，分别补饲以纯木薯（CS，n=8）、玉米（MS，n=8）和豌豆淀粉（PS，n=8）（直/支链淀粉比分别约为0.11，0.27和0.44）为唯一淀粉来源的精料补充料。结果显示，不同淀粉源开食料对未断奶羔羊生产性能无显著影响；饲喂高直链淀粉源（豌豆淀粉）开食料可通过促进羔羊内源GLP-2的分泌，推动小肠上皮细胞周期进程，进而促进断奶前羔羊小肠上皮的生长发育，暗示GLP-2可能在调节小肠生长发育方面起着十分重要的作用。为了进一步研究GLP-2对羔羊小肠发育的直接作用，试验2研究GLP-2对羔羊小肠生长发育及上皮细胞周期相关基因mRNA表达的影响。试验选择10只体况良好、胎次一致、体重相近的刚出生的羔羊（湖羊）随机分为两组，分别为对照组（0.5%的牛血清白蛋白，溶于生理盐水）和GLP-2处理组（50μg GLP-2/kg BW，溶于0.5%的牛血清白蛋白中），每组5只。结果显示，皮下注射GLP-2升高了羔羊小肠上皮细胞周期蛋白和GLP-2相关基因mRNA的表达量，促进了小肠发育。试验3利用体外细胞培养实验进一步研究GLP-2促进小肠上皮生长发育的机理。结果发现，体外添加GLP-2后2小时可以显著促进空肠细胞增殖，并且主要通过IGF-1信号通路来发挥作用。研究结果将有助于进一步揭示羔羊小肠发育的关键机制，将为相关营养策略的制定提供理论依据。