TOPK磷酸化c-Jun促进EGFR-TKIs耐药肺癌细胞生长的分子机制研究

Our previous study indicated that both TOPK and c-Jun are highly expressed in EGFR-TKIs resistant lung cancer cells and also in lung cancer tissues. The colony number decreased dramatically in TOPK knockdown A549 cells compared with TOPK wild type A549 cells. In further study, we found that TOPK can bind with and phosphorylate c-Jun in vitro and ex vivo. In this project, we first focus on the phenotype study of TOPK in soft agar and xenograft model; and second, we will identify the TOPK phosphorylation sites of c-Jun and validate these phosphorylation sites in vitro and ex vivo. Third, we will study c-Jun and AP-1 function affected by TOPK phosphorylation,and then validate TOPK and c-Jun signal pathway changes in vitro and ex vivo. At last, we will identify c-Jun target genes and study their functions in lung cancer cell growth.This project will elucidate the molecular mechanism of TOPK in EGFR-TKIs resistant lung cancer development,and make contributions to personalized medicine in lung cancer treatment by setting TOPK as a new molecular target.

非小细胞肺癌对EGFR-TKIs的多重原发和继发耐药是目前急需攻关的难题。TOPK是新发现的参与有丝分裂纺锤体形成的重要激酶。本课题前期研究发现EGFR-TKIs不敏感的肺癌细胞株和肺癌组织都存在TOPK高表达现象，在耐药A549细胞阻断TOPK表达可显著减少软琼脂中的克隆数。进一步研究发现TOPK可以和c-Jun相结合，体外磷酸化分析表明TOPK可以磷酸化c-Jun。因此本课题着重研究TOPK磷酸化c-Jun的具体分子机制；这些磷酸化位点对c-Jun的功能调节以及AP-1转录活性的影响；c-Jun靶基因的鉴定及初步生物学功能研究；确立TOPK通过c-Jun促进TKIs耐药肺癌生长的细胞表型；采用裸鼠模型，观察阻断TOPK和c-Jun对A549细胞皮下成瘤的影响。本课题丰富了TKIs耐药肺癌细胞生长的分子机制，为肺癌生物治疗提供了TOPK这一新靶点。

肺癌是严重威胁人类生命健康的重大疾病，也是全球癌症相关性死亡的首要原因，其中NSCLC约占85%。当前，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）在NSCLC治疗方面获得了巨大的成功，已发展成为肺癌治疗的一线药物。尽管如此，临床中大部分EGFR突变阳性患者经过一段时间的治疗后对EGFR-TKIs产生继发性耐药，因此对EGFR-TKIs获得性耐药机制及其临床应对策略的研究成为靶向治疗领域的又一研究热点。现有研究表明，非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药机制主要表现为细胞绕过EGFR直接通过其下游分子来激活肺癌细胞生长的信号通路。因此，越来越多的研究者开始关注EGFR信号通路的下游分子以及与肺癌生长密切相关的一些蛋白激酶，以克服EGFR-TKIs的耐药问题。.TOPK是一种由322个氨基酸构成的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，首次发现于淋巴因子激活的杀伤性T细胞。以往研究表明，TOPK与有丝分裂期间纺锤体的功能密切相关，TOPK的敲除将导致细胞胞质分裂的推迟。近年来的研究发现，TOPK在多种肿瘤细胞中呈强表达，与肿瘤的发生发展密切相关。TOPK与细胞内多个凋亡相关蛋白的活化和表达有关，参与调控细胞的凋亡。已有研究发现，稳定干涉TOPK表达后，可以对细胞内的一些凋亡相关蛋白以及细胞周期蛋白的表达水平产生不同程度的影响，提示TOPK可能在癌症耐药过程中具有重要的作用。AP-1是一个二聚体的转录因子，包含可以与DNA结合的亮氨酸拉链结构域。Jun（c-Jun，JunB 和JunD）和Fos（Fos，FosB，Fra-1，Fra2）亚家族是主要的AP-1蛋白。现有证据表明，AP-1在肿瘤细胞的增殖、转化等方面发挥了重要作用。c-Jun是癌基因，c-Jun活化后可以调节靶基因转录，从而参与细胞的生长、分化和凋亡等多种生理过程。c-Jun的调节与AP-1的转录活性密切相关。但c-Jun已知最主要的调节蛋白是JNK（c-Jun amino-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶)。JNK是丝裂原激活的蛋白激酶超家族成员，JNK接受上游信号后被激活，从而与c-Jun结合并且磷酸化2个丝氨酸/苏氨酸丛，Ser63/73和Thr91/93，进而激活c-Jun增强其转录活性。c-Jun磷酸化后转录活性增强，蛋白的半衰期显著延长。但是JNK只在各种应激状态下被激活，