平滑肌外泌体介导CRISPRi技术调控PDE5和JAK2基因治疗糖尿病ED的实验研究

Erecrtile dysfunction is prevalent in diabetic patients, who have a poor response to PDE5 inhibitors. To explore novel modalities and mechanisms is the future for ED treatment. Current researches mainly focus on gene therapy, especially on therapeutic targets and proper vehicles. PDE5 in NO-cGMP pathway is the prior target for ED treatment. Our previous study has proven that JAK2 pathway plays a vital role in diabetic erectile dysfunction. The activation of JAK2 pathway could lead ED via injuring cavernous smooth muscle and dampening the relaxation of smooth muscle. Exosomes are non-viral non-cell biovesicles, possessing low immunogenicity and the ability to migrate to targeted cells, which is an ideal carrier for gene therapy. Current study is to construct cavernous smooth muscle cell-derived exosomes equipped with CRISPRi system and to focally knock down targeted classical PDE5 or / and JAK2 genes studied by applicants. Aims to increase cGMP concentration and promote the regeneration of smooth muscle cells in the penis. We will explore the possible mechanisms related to this modality. The aforementioned study will provide evidence for the potential exosome based gene therapy for diabetic erectile dysfunction.

糖尿病患者勃起功能障碍（ED）发病率高，药物疗效欠佳，探索新的治疗方法和机制是目前研究的主要方向，基因治疗是研究热点，其中靶点和载体选择尤为重要。NO-cGMP通路的PDE5是目前治疗ED的首选靶点。申请者先前研究表明JAK2通路在糖尿病ED中起重要作用，该通路激活可导致平滑肌细胞损伤、舒张功能下降而导致ED。外泌体是一类非病毒非细胞物质的生物小囊泡，具有免疫原性低、可向靶细胞定向移动的特性，被认为是一种理想的基因载体。本项目拟通过构建搭载CRISPRi系统的平滑肌外泌体，将其注射入阴茎海绵体内，靶向局灶敲减经典PDE5基因或/和申请者所研究的JAK2基因，增加平滑肌cGMP含量，促进平滑肌损伤修复，提高ED治疗效率；同时在细胞和分子水平探讨外泌体介导CRISPRi调控PDE5、JAK2基因增强糖尿病ED大鼠勃起功能可能的作用机制，这将为外泌体运载的基因治疗糖尿病ED提供科学依据。

糖尿病性勃起功能障碍（ED）是常见的男性性功能障碍之一，PDE5是当前一线治疗药物的作用靶点，但治疗效果不佳。JAK2已被证明在糖尿病ED中被激活，参与细胞凋亡和组织纤维化等病理过程，加重或导致ED。CRISPR干扰技术（CRISPRi）作为当今最新的内源性基因编辑技术，可在不改变受体基因组序列的情况下，抑制目的基因的表达，已得到迅速推广。. 本课题组首先构建CD9-HuR（一种RNA结合蛋白）过表达修饰的293T细胞，并在dCas9蛋白序列的下游添加AU富集序列（AREs；可被HuR识别并结合），以增加外泌体对CRISPRi体系的转运能力；后利用293T细胞分泌的外泌体介导CRISPRi技术，在体内外下调PDE5和JAK2基因的表达，评价其对大鼠勃起功能的影响。我们的研究显示：（1）利用CRISPRi技术可以成功下调阴茎海绵体平滑肌原代细胞（CCSMCs）中PDE5和JAK2基因的表达水平；（2）CD9-HuR过表达修饰的293T细胞分泌的外泌体，可成功搭载CRISPRi体系（dCas9-AREs和sgRNA），下调CCSMCs中PDE5和JAK2基因的表达水平；（3）高糖环境下CCSMCs的细胞活力下降，凋亡及RhoA/ROCK通路的水平增加。外泌体介导CRISPRi技术可通过下调PDE5和JAK2基因表达来提高CCSMCs的细胞活力，下调凋亡及RhoA/ROCK通路的水平；（4）成功构建糖尿病ED大鼠模型；（5）阴茎海绵体局部注射搭载CRISPRi体系的外泌体，可在一定程度上改善糖尿病大鼠的勃起功能；（6）糖尿病ED大鼠阴茎海绵体中凋亡、纤维化及RhoA/ROCK通路水平增加，NO-cGMP通路水平下降。外泌体介导CRISPRi技术可通过下调PDE5和JAK2基因表达来改善海绵体中凋亡、纤维化及RhoA/ROCK通路水平，并上调NO-cGMP通路的表达。. 本项目利用外泌体介导CRISPRi技术调控PDE5和JAK2基因探索了双基因联合调节在糖尿病ED中的作用机制。我们的研究发现，PDE5及JAK2基因表达的增加参与糖尿病ED的发病过程，同时伴随阴茎海绵体中凋亡、纤维化及RhoA/ROCK通路水平增加，NO-cGMP通路水平下降。而下调PDE5和JAK2基因表达可以在一定程度上逆转上述变化并提高勃起功能。该发现为安全高效治疗糖尿病ED提供新的方法。