猪链球菌噬菌体穿孔素（holin）的膜拓扑结构与功能解析

猪链球菌2型是重要的人兽共患病原菌，菌株多呈严重耐药和多重耐药，抗生素应用面临挑战，基于噬菌体的抗菌策略再现潜力。噬菌体穿孔素(Holin)具有介导细菌裂解的功能，但猪链球菌噬菌体的裂菌机制尚不清楚。本研究将聚焦猪链球菌噬菌体穿孔素，通过构建穿孔素重组λ噬菌体，基于大肠杆菌遗传体系，采用半胱氨酸定点突变扫描技术，解析穿孔素的膜拓扑结构；通过定位突变，分析穿孔素的双起始基序，揭示穿孔素不同跨膜区、功能域及关键氨基酸对触发细菌裂解的作用；构建穿孔素-GFP表达系统，应用反卷积荧光显微镜，观察穿孔素在细胞膜上的实时定位特征；采用化学交联技术和原子力显微镜，分析穿孔素在细胞内外的寡聚形式、成孔形状、孔径大小等，解析穿孔素的成孔模式。通过研究，初步揭示猪链球菌噬菌体穿孔素介导的裂解触发机制，为研发基于噬菌体裂解系统的新型抗菌制剂提供理论依据和技术支撑，也为研究革兰阳性菌噬菌体的裂菌触发机制提供参考。

穿孔素(holin)是由噬菌体编码的裂菌相关功能蛋白，具有抗菌应用潜能，但国内外对猪链球菌噬菌体穿孔素鲜有研究。本项目聚焦猪链球菌噬菌体穿孔素(HolSMP)的结构与功能，系统分析了穿孔素的基因结构和双起始基序，明确了穿孔素的亚细胞定位，解析了穿孔素膜拓扑结构与胞外裂菌功能，揭示了穿孔素的膜成孔特征，初步阐明了猪链球菌噬菌体穿孔素的触发裂菌机制。.基于生物信息学分析发现，穿孔素基因(HolSMP)定位于裂解酶基因(LySMP)上游，位于基因组7267-7695位，全长429bp。HolSMP基因可补偿穿孔素基因缺陷型λ 噬菌体的噬菌斑形成功能。该基因在大肠杆菌中表达可导致细菌裂解，并且能量毒素氰化钾可提前触发HolSMP形成跨膜通道，引起菌体裂解。同时穿孔素HolSMP和裂解酶LySMP的共表达可迅速触发细菌裂解，发挥胞内协同裂菌功能。.HolSMP的转录与表达特征显示，噬菌体感染宿主菌后20min，HolSMP基因开始转录和表达，于60min时达峰值，呈现触发裂菌特征。基于膜蛋白提取技术、蛋白免疫印迹分析和基于GFP-HolSMP融合蛋白的共聚焦显微镜观察，发现HolSMP定位于细胞膜，其动态变化特征呈现λ 噬菌体穿孔素的触发裂菌模式。.穿孔素HolSMP含有10个由“ATG”编码的甲硫氨酸，以前5个“ATG”为起始密码子的HolSMP片段均可导致裂菌，其中以第五个“ATG” 为起始密码子的，其触发裂菌时间点提前20 min，而该密码子发生突变后却又导致裂菌触发延迟15 min。提示HolSMP具有与λ 噬菌体穿孔素S基因相似的穿孔素-抗穿孔素（holin-antiholin） “双起始”基序。.基于半胱氨酸定点突变扫描技术(SCAM)解析了穿孔素HolSMP的膜拓扑结构，揭示了穿孔素的关键氨基酸在膜内外的分布特征。发现G35C、T80C和Y105C三个关键位点分布于细胞膜内，分别参与形成三个跨膜区。其N-端和C-端均位于膜外，其中N-端位于细菌细胞周质，C-端位于细胞质，提示HolSMP具有Ⅰ型穿孔素的结构特征。进一步研究发现，缺失任一跨膜区均会导致穿孔素活性降低或丧失，而且，跨膜区单个氨基酸突变亦显著影响穿孔素功能，提示穿孔素裂菌功能对其编码序列十分敏感。.基于HolSMP的触发裂菌特点、双起始基序特征和膜拓扑结构，提示其具有类似λ噬菌体穿孔素的触发裂菌机制。