猪链球菌噬菌体裂解酶的功能域解析及基于三维结构的底物识别机制研究

Streptococcus suis serotype 2 (SS2) is an important zoonotic pathogen, and the increasing prevalence of antibiotics resistant SS2 strains becomes one of the greatest challenges worldwide. LySMP, a peptidoglycan hydrolase （lysin） encoded by SS2 bacteriophage, has been examined as potential agent for SS2 control, but its enzyme kinetics and bacteriolytic molecular mechanism are still open. This proposal will focus on the revelation of three-dimensional (3D) structure of LySMP and the elucidation of molecular recognition of bacterial peptidoglycan by LySMP. So, the characteristics of catalytic domain and binding domain of LySMP, including the catalytic active site residues and even the cleaved bonds in peptidoglycan will be investigated by using bioinformatics, site-directed mutation and negative ion mass spectrum. The receptor of LySMP binding domain will be characterized by co-immunoprecipitation and mass spectrum. The LySMP binding constants and catalytic efficiency will be measured by using a combination of isothermal titration calorimetry (ITC) and surface plasmon resonance (SPR) in conjunction with active site mutants and deletion constructs. The 3D structure of LySMP will be reconstructed by crystallization and X-ray diffraction or homology modeling, and the 3D structure of peptidoglycan or LySMP-peptidoglycan complex will be solved by nuclear magnetic resonance( NMR) spectroscopy. These findings will allow the mechanism to be revealed on how LySMP recognizes and lyses the bacterial cell wall, which is crucial to improve and reconstruct the LySMP for the control of SS2 infection.

猪链球菌2型是重要的人兽共患病原菌，临床菌株多呈严重耐药和多重耐药，应用抗生素治疗面临挑战。猪链球菌2型噬菌体编码的裂解酶LySMP因呈现高效裂菌活性而具有抗菌应用潜力，但其介导裂菌的酶学基础和裂菌机制尚不清楚。本项目将聚焦LySMP的功能域解析和底物识别机制研究：通过生物信息学、定位突变和负离子质谱分析，解析LySMP的催化域和结合域，揭示酶活性中心、酶切作用靶点；应用免疫共沉淀和质谱分析，发掘猪链球菌细胞壁上的LySMP结合域受体；利用等温滴定量热法（ITC)和表面等离子共振（SPR）技术，测定LySMP的底物结合常数和催化效率，阐明酶学特征。采用蛋白质结晶、X射线衍射和同源建模解析裂解酶的三维结构，并基于核磁共振技术重建猪链球菌肽聚糖的三维结构，进而揭示裂解酶-肽聚糖复合物的动态三维结构特征，最终阐明LySMP的底物识别和裂解机制，为研制防控猪链球菌病的高效裂解酶奠定理论和应用基础。

针对人畜共患病原菌猪链球菌对抗生素严重耐药和多重耐药的严峻形势，本项目聚焦一种新型、高效抗菌分子——猪链球菌噬菌体裂解酶，重点研究其介导细菌裂解的酶学基础、三维结构、裂菌机制和抗菌应用潜力。.基于生物信息学，成功挖掘到一种新型裂解酶Ly7917，其由N端催化结构域CHAP和C端结合结构域SH3b组成，二者分别发挥催化裂菌和结合细菌肽聚糖靶位的功能。该裂解酶对多个不同血清型的致病性猪链球菌均具有广谱、高效裂解能力，且对温度和pH等环境条件不敏感，呈现高效、稳定的裂菌活性。基于小鼠腹腔感染和肌肉切口感染两种模型，发现裂解酶具有良好的体内裂菌和抗感染效果。.通过原核表达、纯化和浓缩，应用座滴式气相扩散法进行裂解酶Ly7917结晶，经条件优化，成功获得高质量的裂解酶晶体，衍射质量达1.9 Å。通过采用SAD法解析相位、phenix精修和coot调校等技术与方法，发现一个单晶胞体中包含两个Ly7917 分子，并成功解析了Ly7917的三维晶体结构（PBD code：5D74），其CHAP催化结构域和SH3b结合结构域的三维结构分别与蛋白4f88和4lxc的高度重叠。在此基础上，获得Ly7917与肽聚糖底物MDP水解产物的复合物晶体并成功解析三维结构（PBD code：5D76），衍射质量达2.5 Å。经分析推断Ly7917发挥酰胺酶活性，裂解MDP中乙酰胞壁酰与L-丙氨基之间的酰胺键。肽聚糖底物的L-丙氨基-D-异谷氨酰胺与SH3b的主要结合位点为176A、180R。.通过构建一系列Ly7917截短蛋白及点突变蛋白，解析了裂解酶的活性功能域及关键氨基酸位点。结果显示N端截短蛋白Ly7917 17–245的活性完全丧失，Q14和S17发生点突变后Ly7917的裂解活性亦丧失。裂解酶催化域CHAP的活性与全酶的活性相当，CHAP的N端序列对其活性影响较大，不宜截短；而C端依次截短后，活性逐渐降低，CHAP1–100为保持裂解活性的最小结构，也是Ca2+结合区域，在添加1 mM Ca2+后活性增强，可媲美全酶。本项目还系统解析了另两个猪链球菌噬菌体裂解酶LySMP和Ply5218的功能域和关键氨基酸位点。.本项目通过对裂解酶三维结构和活性位点分析，阐明了裂解酶底物识别和裂菌机制，发现了可供改造的功能域和关键活性位点，为进一步应用噬菌体裂解酶开展临床研究及药物开发提供了理论依据。