NMDA受体转运介导耳蜗兴奋毒性的机制探讨

NMDA 受体是兴奋性最强的谷氨酸受体，NMDA受体转运不仅与突触可塑性调控有关，而且与神经兴奋毒性关系密切。耳蜗螺旋神经节神经元（SGN）的NMDA受体介导的兴奋毒性是水杨酸耳毒性的原因之一，但其作用机制尚未清楚。SGN的NMDA受体转运可能与水杨酸的耳毒性有关。本研究拟采用膜片钳技术，观察水杨酸钠对SGN胞膜对NMDA受体的单通道和全细胞通道的功能及对受体转运影响的电生理学特点，结合免疫细胞化学技术，观察水杨酸钠对NMDA受体的表达及受体转运的影响，最后，通过分子生物学技术构建C-末端切除的NMDA受体重组体的细胞模型，探索水杨酸钠影响NMDA受体转运的作用位点。本研究将从多角度阐述水杨酸钠影响耳蜗SGN的NMDA受体转运的机制，揭示NMDA受体转运在耳蜗兴奋毒性中的地位，探讨兴奋毒性致聋的深层分子机制和最终的共同病理环节，为耳聋的防治和开发防聋治聋新药提供新的理论依据。

本课题以原代培养Wistar 大鼠耳蜗螺旋神经节神经元（SGNs）为研究对象，以膜片钳技术、细胞免疫化学技术及分子生物学技术为手段，研究SGNs 的NMDA 受体转运介导耳蜗兴奋毒性的作用机制。本研究的完成了课题原方案的大部分研究内容，并根据研究中的新发现，扩展了部分研究内容，取得以下几个结果：(1)利用全细胞膜片钳技术发现：①NMDA浓度范围在0.1mM-10mM，均未记录到NMDA受体电流，当同时给予5mM水杨酸钠时， 0.1mM和0.5mM的NMDA均可引出明显的NMDA电流，并有浓度依赖性。②水杨酸钠对大鼠SGNs 电压门控钾通道电流具有抑制作用，使其电流峰值减低、激活曲线向超级化方向移动。③耳蜗螺旋神经节神经元可诱出GABAa受体电流，GABA 诱导的GABAa受体电流呈浓度依赖性。(2)采用实时荧光定量PCR研究发现水杨酸钠作用后，NR1亚单位的表达明显增强。(3)应用免疫染色技术发现：①水杨酸钠处理15min后，能促进SGN表面NMDA受体的内化。②在体外培养的大鼠耳蜗器官中，水杨酸钠选择性损伤SGN及其神经纤维，并呈浓度和时间依赖性。水杨酸钠诱导的SGN凋亡可同时由caspase依赖性与caspase非依赖性细胞凋亡通路介导，其中caspase 通路同时启动了胞外死亡受体相关通路和胞内线粒体通路。水杨酸钠诱导SGN凋亡与超氧化物阴离子产生增加有关。(4)采用western blot技术发现：①在水杨酸钠处理（5min,15min,30min）后，总NR1蛋白的表达量没有明显改变，而表面NR1的蛋白表达量却明显减少。②水杨酸钠处理（1h,3h,6h）后，可诱导细胞总NMDA受体表达增加。动力蛋白阻断剂DIP可以抑制水杨酸钠引起的NR1的内化作用。水杨酸钠能上调原代培养SGNs的Caspase 3 mRNA 及蛋白的表达，导致SGNs调亡。所有这些发现，目前国内外未见有相似报道。