黑质多巴胺能神经元在睡眠-觉醒调节中的作用及分子机制

Sleep disorders are becoming increasingly serious medical and social problem. Most disorders especially neurologic disease are often concurrent with sleep disturbance. Sleep disorders are common in PD with incidence of about 64%. The prominent pathological change of PD is the degeneration and death of dopaminergic neurons in the midbrain Substantia nigra (SN). But how sleep-wake behaviors will change after specific loss of SN dopaminergic neurons? Whether direct activation or inhibition of SN dopaminergic neurons can initiate and/or maintain wakefulness or sleep? These are the core problems to be solved. To clarify the role of SN dopaminergic neurons in sleep wake regulation, the present research will adopt pharmacogenetics DREADD and optogenetics to directly and specifically activate or inhibit neurons in SN, in combination with methods and skills including in vitro electrophysiological recording, sleep behavior recording and analysis system, neurochemistry lesion, specific trace and immunohistochemistry staining. Our predicted results will reveal the neurobiological mechanisms of SN regulation in sleep-wake behavior and provide an insight in sleep disorders of SN dysfunctions, which will provide theoretical basis for discovering new targets of clinical intervention.

睡眠障碍正成为日益严重的医学和社会问题。很多疾病尤其是神经系统疾病常合并睡眠障碍。近年来研究发现有64%的帕金森病（Parkinson’s disease，PD）患者合并有睡眠障碍。PD的病理改变是中脑黑质（Substantia nigra, SN）多巴胺能神经元的变性死亡，但SN多巴胺能神经元特异性丢失对睡眠有何影响？直接激活/抑制SN多巴胺能神经元是否可以启动或/和维持觉醒/睡眠？其机制如何？这些是亟待解决的核心问题。本申请将借助遗传药理学DREADD法和光遗传学特异性地激活/抑制神经元，结合离体脑片电生理记录、基于脑电描记的睡眠行为解析系统、神经化学核团毁损、特异性示踪以及免疫组织化学等方法，阐明SN多巴胺能神经元在睡眠-觉醒调节中的作用，并探索其分子机制。预期结果将揭示SN调节睡眠-觉醒的神经生物学基础，以及SN功能异常性睡眠障碍的发病机制，为寻找临床干预新靶点提供理论依据。

睡眠障碍是帕金森病常见的非运动症状。多巴胺对睡眠觉醒的调节作用尚不清楚。我们采用药理遗传学方法特异性操控多巴胺能神经元并结合免疫组化等方法开展研究，脑片膜片钳发现CNO能抑制hM4Di-expressing多巴胺能神经元，腹腔注射CNO不引起hM4Di-expressing小鼠c-Fos蛋白表达，提示CNO分别在离体和在体水平抑制多巴胺能神经元。CNO抑制VTA多巴胺能神经元能使4h内小鼠总非快速眼动（non-rapid eye movement, NREM）睡眠时间增加25.6%，觉醒减少36.9%。而抑制SNc多巴胺能神经元使小鼠在CNO注射后3小时内总NREM睡眠增加45.5%，觉醒减少37.8%。通过对睡眠结构进一步分析发现，抑制VTA和SNc多巴胺能神经元分别引起8-64min 和4-16min NREM睡眠片段增加。以上结果多巴胺能神经元在觉醒调节中起重要作用。除多巴胺外，另一种重要的中枢神经系统内广泛存在的神经递质谷氨酸，也在觉醒调节中起重要作用，而结节乳头核（tuberomammillary nucleus, TMN）存在大量的组胺能神经元，是重要的觉醒相关核团。我们采用脑片膜片钳技术、脑立体定向微注射结合多导脑电及肌电记录及免疫组化开展研究。结果发现，谷氨酸及其离子型受体激动剂NMDA、AMPA分别使TMN组胺能神经元放电频率增加1.72倍、1.49倍、1.13倍。而微注射谷氨酸（0.5 nmol/side）至大鼠TMN后4 h中动物觉醒时间增加了72%，NREM睡眠时间减少了49%。谷氨酸再摄取抑制剂DHK及谷氨酸离子型受体激动剂NMDA、AMPA能剂量依赖地增加大鼠觉醒时间，抑制NREM睡眠和快速眼动（rapid eye movement, REM）睡眠。NMDA受体拮抗剂MK-801能减少TMN组胺能神经元放电、增加NREM睡眠时间，并能抑制谷氨酸引起的觉醒时间增加。预处理给予组胺H1受体拮抗剂能阻断谷氨酸的促觉醒效应。以上结果提示谷氨酸能激活TMN组胺能神经元并促进大鼠觉醒，NMDA和组胺H1受体可能介导了谷氨酸的觉醒效应。我们的研究提示多巴胺能神经元缺失可能是引起PD患者日间睡眠过多等睡眠障碍的病理学基础，揭示了TMN谷氨酸促觉醒作用及机制，本研究结果丰富了睡眠研究基础理论，为进一步开展相关临床研究提供理论支撑。