热辅助超声波杀菌过程中鼠伤寒沙门氏菌VBNC状态形成及控制研究

A bacterial cell in the viable but nonculturable (VBNC) state may be defined as in a special dormancy state responding to environmental stress, which challenged extremely highly of the food inspection and public health security. In this study, molecular biology methods were used to evaluate induction of VBNC Salmonella typhimurium in broth and juices as exposed to thermosonication (TS) treatment. The effects of bacterial growth phase, TS treatment conditions, generation of H2O2 and oOH on induction of VBNC state and intervention of resuscitation were investigated to reveal the dominant induction factors. Further more, the characteristics of micromorphology, membrane, endoenzymes, protein expression, nucleic acid, and tolerance of heat and sonication treatments were investigated, as to state the VBNC formation mechanism. Based on the understanding of induction, resuscitation, induction factors and formation mechanism, an approach of controlling the VBNC induction and resuscitation was to be established. This research will offer new theories foundation and technical guidance to sterilization of liquid foods using TS.

微生物活的但非可培养（Viable but nonculturable, VBNC）状态是其应对外界不良环境形成的一种特殊休眠状态，其存在对食品检验和公共健康安全提出了极高挑战。本项目采用分子检测技术分析热辅助超声波（thermosonication, TS）处理诱导培养基和果汁等体系中鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）进入VBNC状态；通过考察微生物生长期、TS处理条件、超声产生的H2O2、oOH自由基等因素对VBNC状态形成和复苏情况的干预，揭示主要诱导因素；进而研究处于VBNC状态的S. typhimurium在形态、内部结构、细胞膜、胞内酶、蛋白质表达、核酸以及对超声波和热耐受能力方面的变化，阐明VBNC形成机理；根据对VBNC状态细菌的形成、复苏、诱导因素和形成机理的理解，建立控制VBNC状态形成以及抑制VBNC状态复苏生长的方案。

微生物以活的非可培养状态（VBNC）存在是其一种生存策略，但致病菌以该状态存在对于食品安全和公共健康显得尤为棘手。本项目以常见致病菌鼠伤寒沙门氏菌为目标菌，建立有效合理的VBNC定量检测方法，考察在热辅助超声波处理（TS）中其进入VBNC状态的情况，分析主要诱导因素，探讨其形成机制，以建立有效调控方法。主要研究结果包括：1）基于RT-qPCR定量检测活菌数量的方法能够有效、高效、准确检测热辅助超声波处理中鼠伤寒沙门氏菌VBNC态细胞数量；2）影响细菌在TS处理中进入VBNC状态的因素主要来源于三个方面，包括细菌自身因素（种属、生长期）、TS处理条件（温度、功率、时间、是否产生自由基）、环境因素（媒介、营养状况、酸度）；3）处于VBNC状态的鼠伤寒沙门氏菌在外部形态和内部结构方面发生了改变，4个毒力基因高表达，几种与氧化还原相关的酶活降低，且TS处理中产生自由基是其进入VBNC状态的非常重要但非唯一机制，但自由基的具体作用位点和机制还需进一步阐明；4）基于自由基对细菌VBNC状态形成重要作用，通过加入自由基清除剂和一些抗氧化剂可以有效阻止VBNC状态发生，但仍不能达到完全控制；5）TS处理中产生的VBNC状态细胞在提高培养温度、添加谷氨酸等氨基酸、4%蛋白胨等可以促进其复苏，吐温80和麦芽糖不利于其复苏。