HIV Tat抗原的结构改造及其颗粒性疫苗的应用基础研究

Tat蛋白是人类免疫缺陷病毒（HIV）转录的反式激活因子，是HIV预防性及治疗性疫苗的重要候选抗原之一。本实验室已完成本项目部分前期试验，分别对HIV-1 HXB2株天然Tat分子半胱氨酸富集区和N端/C端区进行重组改造，获得了分子构象相对稳定的新型Tat免疫原（rTat）。再此基础上，本项目拟构建并表达含该rTat及一个通用型辅助性T淋巴细胞表位和以高疏水性丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白119-191aa为载体的颗粒性融合蛋白；免疫小鼠及家兔，观察其免疫原性和诱导抗体的交叉反应性。以能阻止荧光标记Tat分子穿入的含PLTR-EGFP质粒的Hela细胞为模型，检测抗体对Tat的直接中和活性；用ELISPOT方法检测细胞毒性T细胞应答；利用免疫电镜定位技术分析Tat融合蛋白的颗粒性特征，以期为获得免疫原性更强、保护作用更好的HIV Tat颗粒性疫苗提供切实的试验依据。

Tat蛋白是人类免疫缺陷病毒（HIV）转录的反式激活因子，是HIV预防性及治疗性疫苗重要的候选抗原之一。在前期工作基础上，本项目根据天然HIV-1 HXB2 Tat分子结构及其各功能区特点，构建并原核表达多种HIV-1 Tat突变体重组蛋白，完成对HIV-1型艾滋病患者血清抗Tat抗体的初步检测分析以及小鼠和新西兰兔的免疫实验。结果显示，全长Tat及不同Tat突变体重组蛋白与抗Tat抗体阳性艾滋病患者血清反应的强度和敏感性不同，其中Tat1-86与艾滋病患者血清的反应性普遍较强，Tat(B41-100N)融合蛋白较好地保留了天然Tat的重要表位结构。用转染pLTR-SEAP的HEK293T细胞为模型检测表明，重组蛋白Tat(B41-100N)和Tat(B41-100C)均已丧失天然Tat蛋白具有的反式激活活性，但两者诱导产生较弱的中和抗体。此外，本项目成功构建不同Tat突变体与高疏水性丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白122-191基因重组的原核表达载体，但用常规的IPTG原核诱导表达方法，HIV-1 Tat及其突变体与HCVC122-191重组质粒的表达未达到预期结果。我们用胶体金标记制备稳定的Tat及其突变体蛋白金标体颗粒并免疫小鼠，以分析Tat颗粒性形成的生物学及免疫学特性，结果表明，用75 nm胶体金标记的Tat及其突变体蛋白的金标体溶液在pH5.5-9.0范围内均保持较好稳定性；胶体金标记对全长Tat1-100和Tat突变体Tat(△31-45)蛋白的免疫原性均有明显增强作用，表位分析显示，与抗全长Tat小鼠抗血清相比，Tat(△31-45)及其金标体免疫小鼠抗血清与Tat1-21和Tat38-61的反应性增强；抗全长Tat、抗Tat(△31-45)和抗Tat(△31-45)金标体三者小鼠抗血清与Tat60-100反应性均明显高于对照组，但三者之间无明显差异。为解决原核系统表达HIV-1 Tat及其突变体与HCV C122-191融合蛋白不理想所存在的问题，我们构建重组pIVEX2.4d无细胞表达质粒，采用无细胞体外表达及SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，获得了两种HIV-1 Tat突变体蛋白（Tat22-100和Tat22-86）分别与高疏水性HCV 核心蛋白122-191aa重组的融合蛋白，经负染法透射电镜检测，Tat(22-86)-HC