HDGF/Nucleolin信号轴影响人大肠癌细胞放射敏感性的作用机制研究

So far, some International studies have reported that HDGF played an important role in regulating radiosensitivity. A recent research demonstrated that nucleolin can be acted as a receptor to combined HDGF on the surface of cell membrane. Furthermore, nucleolin was found to be a shuttle proteins within the cell, can carry a variety of DNA damage repair genes involved in radiation sensitivity regulation. So we speculate that HDGF can be involved in radiation sensitivity regulation through interacting with nucleolin. This study aims to further discern the interaction between HDGF and nucleolin in human colorectal cancer cells in and then to assess the HDGF’s influence for Nucleolin’s subcellular localization. In addition, the present study will continue to explore the mechanisms involved in regulating repairmen of ionizing radiation induced DNA damage by HDGF and Nucleolin interaction system and finally to get clear the downstream target genes for HDGF/nucleolin in response to DNA damage and repair. Our researches are expected to reveal the mechanisms for regulating the radiosensitivity of HDGF in colorectal cancer, which may provide a novel therapeutic target to improve radiotherapy

目前国际已有研究报道HDGF与放疗敏感性调控关系密切，新近研究发现nucleolin可作受体在细胞膜表面与HDGF结合。而nucleolin被发现是一种胞内穿梭蛋白，可携多种DNA损伤修复基因参与放疗敏感性调控。我们前期预实验发现在电离辐射可使大肠癌细胞中HDGF和Nucleolin表达均发生显著改变。因此我们推测HDGF可通过与nucleolin结合，参与放疗敏感性调控。本研究旨在进一步深入研究：（1）明确人大肠癌细胞中HDGF和nucleolin的相互作用（2）评估下调HDGF对Nucleolin亚细胞定位的影响；（3）明确HDGF/Nucleolin轴在参与电调控放疗敏感性中所起的作用及机制；（4）探寻HDGF/nucleolin信号在放疗所致DNA损伤修复中起作用的下游靶基因。有望揭示HDGF对大肠癌放疗敏感性的调控机制，为提高放疗疗效提供新的治疗靶点。

放疗抵抗是限制放疗在结直肠癌治疗中应用的主要原因。探索靶向调控结直肠癌放疗敏感性的关键基因成为研究热点。近年研究发现肝细胞癌衍生生长因子（hepatoma-derived growth factor, HDGF）与肿瘤放疗敏感性关系密切。DNA双链断裂是电离辐射导致细胞死亡的重要原因，而核仁素（Nucleolin, NCL）是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质。研究表明 NCL在胞膜-胞浆-胞核中的穿梭功能对放疗所致的DNA 损伤修复中起关键作用。近期研究表明HDGF可与NCL相互作用形成一种核蛋白复合体。本课题首先研究HDGF对结肠癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响，随后沉默HDGF，研究HDGF是否通过与NCL蛋白相互作用来调控结肠癌细胞的放射敏感性。方法: 1.应用RNA干扰慢病毒载体转染技术，构建沉默HDGF表达的稳转结肠癌细胞株，通过CCK-8法、克隆形成法、流式细胞术、Transwell小室及划痕实验分别检测HDGF下调对各组细胞放疗前后细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及侵袭迁移等生物学行为的影响。2.通过胞浆胞核蛋白分离试剂盒，借助Western-blot和免疫荧光技术检查放疗前后HDGF及NCL亚细胞定位变化，并明确HDGF下调对放疗前后NCL的核-浆转位、DNA损伤修复、细胞周期、内质网应激及凋亡相关蛋白的表达变化。结果：HDGF沉默可明显抑制结肠癌细胞增殖，侵袭及转移，促进凋亡发生。进一步分析显示, 随着电离辐射剂量增加, HDGF及NCL总蛋白表达逐渐下调，且两者在胞核中的表达均下调，但在胞浆中表达逐渐升高，这提示放疗驱使HDGF和NCL由核转位至胞浆。此外，沉默HDGF使接受放疗大肠癌细胞中:DNA损伤修复相关因子γ-H2AX、NF-κB及p53的表达均出现下调，细胞凋亡相关分子Bcl-2下调而Bax上调，同时还影响内质网应激相关蛋白: ATF6、CHOP及GRP78的表达出现上调。结论：沉默HDGF基因能在体内体外抑制结肠癌细胞增殖、促进其凋亡，在体外抑制结肠癌细胞的迁移能力，影响NCL发生胞核-胞浆转位，参与调控DNA的损伤修复过程，增加结肠癌细胞的放射敏感性, 这暗示HDGF/NCL信号轴不失为调控结肠癌细胞放射敏感性的重要靶向分子通路。