鲢鱼下脚料内源CPIs的纯化鉴定及其在骨生长中的调节作用研究

针对当前我国内陆高产、价廉的淡水经济鱼种- - 鲢鱼经加工后产生大量废弃下脚料，不仅污染环境，而且成为开发鲢鱼制品、提升产品附加值进而促进养殖业可持续发展的制约性因素；同时，结合目前对鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制因子（CPIs）结构和功能的研究尚十分欠缺的现状，本项目拟采用蛋白层析技术，从鲢鱼下脚料（皮、卵、内脏等）中纯化制备含量丰富的CPIs，并鉴定其理化性质和生物学活性特征；在此基础上，利用组织、细胞培养及动物模型等手段，从细胞水平、组织学水平、生理生化水平，研究鲢鱼CPIs在骨生长中潜在的调节作用，并揭示CPIs与骨生长相关细胞因子、半胱氨酸蛋白酶之间的关系，以探明CPIs调节骨生长的作用机制。本研究成果不仅可以填补鲢鱼CPIs研究的空白，并且为将来开发以鲢鱼CPIs为功能成分的食品或饲料级活性添加剂，充分利用淡水鲢鱼资源，变废为宝，提供科学可靠的理论依据。

我国高产价廉淡水鲢鱼加工后产生大量废弃下脚料，不仅污染环境而且造成资源浪费；目前对鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制因子（CPIs）结构和功能的研究尚十分欠缺。为此本项目首先采用蛋白层析技术，从鲢鱼下脚料中纯化制备CPIs，并通过抑制反应、电泳、高效液相、MALDI-TOF-MS等技术鉴定其理化性质和生物学活性特征；结果纯化了6KD非竞争性抑制剂、11KD和14KD的竞争性抑制剂，以及糖基化的44KD、125KD竞争性抑制剂。各CPIs均具有良好的热及pH稳定性。其中14KD CPIs为Cystatin家族成员（Cystatin C）。44KD和125KD应为kininogen家族成员。进而首先成功建立MC3T3-E1小鼠成骨细胞系（OB）分化为骨细胞和RAW264.7 细胞分化为成熟破骨细胞（OC）的体外高效培养体系。继而从细胞水平结合形态学、生物化学、ELISA、免疫荧光组化技术，分别检测了Cystatin C对OB增殖分化3阶段所形成的特定标志物和关键调节因子的影响；对Raw264.7细胞向OC分化以及对成熟OC功能的影响；并利用外植体培养从组织水平研究其在骨生长中的调节作用。结果表明1000ng/ml Cystatin C能缩短MC3T3-E1细胞增殖期；显著增加碱性磷酸酶ALP活性及钙结节数量；显著上调BMP-2表达量，显著下调OCN表达量，还能显著增加小鼠颅骨外植体骨片厚度，加速矿化成骨。100ng/ml Cystatin C导致分化的OC肌动蛋白环宽度变窄；相比对照组的明显伪足小体带，10ng/ml组OC伪足小体环不能融合成小体带，100ng/ml组仅为实心小体簇；100ng/ml组OC亮区面积显及Cathepsin K免疫荧光染色亮度及范围明显减小；且ELISA显示CathepsinK分泌水平显著下降；OC与骨片共培养时Ca2+浓度显著降低，两指标均呈剂量依赖。向成熟OC的培养体系中加入Cystatin，发现以上检测指标也显著下调。综上结果说明100ng/ml Cystatin能明显抑制OC分化成熟及 Cathepsin K分泌，同时对成熟OC的功能也具有抑制作用。综上鲢鱼Cystatin C具有潜在的调节骨生长的作用。研究成果填补了鲢鱼CPIs研究的空白，揭示了鱼类CPIs与骨生长相关细胞、调节因子及酶之间的关系，为阐明其调节骨生长的作用机制奠定十分必要的基础