鼠诱导性多能干细胞向内耳毛细胞和螺旋神经元诱导分化的实验研究

应用干细胞移植替代损伤的毛细胞和螺旋神经元从而达到听觉功能修复是听觉医学研究的新领域。寻找一种取材方便，体外容易培养，易于诱导成为毛细胞和螺旋神经元的干细胞，是内耳干细胞移植的研究方向之一，从一些干细胞向内耳毛细胞和螺旋神经元诱导分化的研究结果来看，胚胎干细胞移植所取得的结果最令人满意，它不仅能够分化为毛细胞和螺旋神经元，而且能够改善耳毒鼠的听力，但是胚胎干细胞有免疫排斥反应和伦理道德两大缺陷。诱导性多能干细胞（iPS细胞）与胚胎干细胞类似，具有多向分化的潜能，在特定的培养环境中能被诱导向特定谱系的细胞分化。为此我们拟研究鼠iPS细胞体外能否分化为内耳毛细胞和螺旋神经元，鉴定由鼠iPS细胞分化的新生毛细胞和螺旋神经元的功能；应用细胞移植方法将iPS细胞移植到耳聋鼠模型的内耳中，探索iPS细胞移植治疗耳聋的新技术，为应用细胞替代治疗感音神经耳聋开辟新的途径。

1、研究背景：感音神经性耳聋是耳鼻咽喉科常见疾病，研究证实其病理变化主要是耳蜗毛细胞及与其相连的螺旋神经元的缺失，且哺乳动物耳蜗毛细胞及螺旋神经元受损后再生十分困难。如果能够找到某种方法修复缺失的毛细胞或螺旋神经元，就有希望治愈感音神经性耳聋。2006 年，日本科学家Shinya Yamanaka等通过导入 Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4四个外源基因将小鼠体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPSCs)。多项研究证实，iPSCs 具有与胚胎干细胞(ESCs)类似的分化能力，却可以避免 ESCs 的免疫排斥及伦理道德问题，因此我们将iPSCs诱导分化为耳蜗毛细胞及螺旋神经元，为感音神经性耳聋的治疗的开辟新的道路。.2、主要研究内容：1.培养iPSCs并鉴定其多能性，并将其与耳蜗 Corti 氏器及耳蜗蜗轴进行共培养，用免疫组化的方法，鉴定iPSCs在体外培养的条件下，是否能够向耳蜗毛细胞及螺旋神经元方向分化；2.将iPSCs移植到正常鼠的内耳中，用免疫组化法鉴定iPSCs在体内是否能够向耳蜗毛细胞及螺旋神经元方向分化，并比较术前术后正常鼠的听力变化，鉴定iPSCs在体内的成瘤性；3.将iPSCs移植到感音神经性耳聋鼠的内耳中，通过免疫组化法和RT-PCR法观察iPSCs在耳蜗内的存活、迁移与分化情况，并通过ABR测试观察耳聋鼠的听力变化，并鉴定畸胎瘤的形成。.3、重要结果：1、成功建立稳定的 iPSCs培养体系，体外共培养方法可成功将iPSCs诱导分化为耳蜗毛细胞样及螺旋神经元样细胞；2、在正常鼠及耳聋鼠内耳中，iPSCs均能够分化为耳蜗毛细胞样及螺旋神经元样细胞；3、圆窗径路移植iPSCs可引起正常小鼠听力的下降，且不能明显改善耳聋鼠的ABR阈值；4、移植iPSCs后，在正常鼠体内可见畸胎瘤形成，在耳聋鼠体内未见畸胎瘤形成。.4、关键数据：1、iPSCs体外培养可形成EB，并能够表达多能性基因Oct4、Nanog、Sox2；2、氯甲基苯甲酰胺(CM-Dil)标记的iPSCs荧光表达强，标记效率达96.42%；3、体外共培养、正常鼠及耳聋鼠内耳中，iPSCs均能够分化为表达毛细胞标志蛋的细胞及神经元标志蛋白的细胞。.5、科学意义：iPSCs在体外体内实验中均可被诱导分化为耳蜗毛细胞样细胞及螺旋神经元样细胞，为将其移植入内耳治疗感音神经性耳聋有初步的科学依据。