Setdb1调控多能性维持与重建的分子机理研究

Setdb1 is one of the important H3K9 methyltransferase, associated with heterochromatin formation and gene silence ,but its biological function is still undefined. There are reports about that repress expression of Setdb1 would lead to differenciation of embryonic stem cells, but we found that when adding ERK inhibitor and GSK3 inhibitor (2i), down-regulation of Setdb1 will not cause a loss of pluripotency . It suggested that the regulation of Setdb1 on pluripotency is affected by signal transduction. Applicant has confirmed that down-regulation of Setdb1 can significantly promote the efficiency of somatic cell reprogramming, so, it’s noteworthy to further research on the mechanism of Setdb1 function swich between mES pluripotency maintenance and somatic cell pluripotency rebuilding. This project will collect cell samples of mES cultured with or without 2i, and pre-iPS samples, take Setdb1 and H3K9 ChIP-seq, analyze data to findout Setdb1 specific target genes in different cell status, establish regulation synthesize, illustrate the interaction between Setdb1 and pluripotency.

Setdb1是组蛋白H3K9的甲基化酶之一，催化形成H3K9me2/me3，与异染色质形成和基因表达沉默相关，但其生物学功能尚不清楚。已有文献报道干扰Setdb1的表达会导致胚胎干细胞分化，我们前期实验发现，在添加ERK抑制剂和GSK3抑制剂（简称2i）的情况下，干扰Setdb1的表达不会导致多能性的丢失，提示Setdb1对多能性的调控受信号转导通路影响。申请人之前证实了干扰Setdb1的表达可以显著促进体细胞的重编程效率，因此，Setdb1在干细胞多能性维持及体细胞多能性重建中功能调控及角色转换机理有待进一步深入研究。本项目计划进行2i培养条件下mES的Setdb1和H3K9的 ChIP-seq，与血清LIF培养条件下的数据以及pre-iPS相关数据进行比较，寻找Setdb1在不同细胞状态下特定调控的靶标基因，建立Setdb1调控模式假说，阐明Setdb1与多能性之间的相互关联机制。

Setdb1（又名Eset或KMT1E）是组蛋白H3K9的甲基化酶之一，催化形成H3K9me2/me3，与异染色质形成和基因表达沉默相关。已有文献报道干扰Setdb1的表达会导致胚胎干细胞向滋养外胚层方向分化，说明Setdb1是ES多能性维持所必需的。而我们之前的研究发现在添加ERK抑制剂和GSK3抑制剂（简称2i）的条件下，Setdb1敲降后多能性能得到维持，说明2i信号通路与Setdb1对多能性维持的调控网络之间存在相互联系。我们通过CRISPR-Cas9技术构建了Setdb1条件敲除ES细胞系，实验发现，在添加2i的情况下，敲除Setdb1的表达不会导致多能性的丢失，滋养外胚层方向分化也被抑制；但细胞的增殖受到影响，Setdb1敲除后细胞不能进行稳定传代，说明Setdb1敲除引起的细胞死亡不是由滋养外胚层分化导致。RNA-seq数据GO分析发现在血清和2i条件下Setdb1敲除后都下调的基因中聚类出DNA修复相关的term，推测Setdb1敲除导致DNA损伤出现，基因组变得不稳定从而启动凋亡，这个推测还有待实验证实。分析H3K9me3 ChIP-seq实验数据发现，Setdb1依赖的H3K9me3 peaks与表达上调的基因不能形成很好的对应关系，反而能与表达上调的Transposable Elements（TE）有很好的对应，推测TE参与了Setdb1敲降后细胞死亡表型的发生。课题发现ES细胞中Setdb1敲除导致死亡不是由于滋养外胚层分化导致，而是存在其它因素，加深了对Setdb1调控多能性的了解。