LIN28A/B对鸡胚胎干细胞多能性维持与增殖分子机理研究

LIN28A/B played an important role in pluripotent maintains and proliferation of chick embryonic stem cells. LIN28A addition improved the chESC proliferation, but the differentiation was happened after passage 6. LIN28B, as an inhibitor of differentiation, would enhance the differentiation-inhibiting effect of LIN28A. 4 factors (LIN28A,LIN28B,Nanog and POUV) with PTD (Protein Transduction Domain) would be produced in large scale through plasmids transfection of 293FT cells respectively, and used to chick embryonic cell culture in vitro. chESCs from Passage 6 and passage 7 were sequenced by CytoSeq (single cell transcriptome sequencing) to identify new genes and their pathway related with differentiation and pluripotent maintains. The molecular mechanism of pluripotent maintains of chESC would be discovered through microRNA, chromatin remodeling and glucose metabolism analysis of whole transcriptome. The functions of new and important genes were measured by direct chESC culture after transient expression of fusion protein with PTD in 293FT, and were certified further by addition of its antagonist. A new culture system of chESC would be constructed and provide a platform for genome edition, transgene and embryonic researches in chick.

LIN28A/B在胚胎干细胞全能性维持和增殖中发挥着重要作用，尽管添加LIN28A使得chESC体外增殖得到了改善，但至6代后细胞出现了分化。LIN28B作为分化抑制因子，可以强化LIN28A的分化抑制效果。利用真核细胞293FT体外分别瞬时表达含有PTD结构域的重组4因子（LIN28A、LIN28B、Nanog和POUV），进行鸡胚盘细胞传代培养。对6代和7代细胞进行单细胞转录组测序，系统分析chESC在分化前后基因表达和网络调控的差异，从小RNA、染色质重塑、糖类代谢等多个侧面阐明chESC多能性维持的分子机制；发掘一批与多能性维持相关的重要基因，通过添加不同阻断剂、体外真核表达新基因的融合蛋白，明确新基因功能；优化培养条件，建立chESC体外长期培养的技术体系，为鸡基因组编辑、输卵管生物反应器和胚胎生物学研究提供重要平台，具有较强的理论价值与应用意义。

背景：.鸡胚胎干细胞（chicken Embryonic Stem Cell,cESC）是研究细胞多能性维持、细胞分化、胚胎发生和器官发育的最佳细胞学模型，同时也可开发鸡输卵管生物反应器，生产治疗人类等疾病的药物或营养品。鸡蛋为多卵黄，其cESC的发育与哺乳动物相比有其独特性，前期研究结果显示：卵黄对胚胎干细胞增殖有着重要影响，且培养至6代时cESC的多能性和增殖能力均出现明显下降。.主要研究内容：.克隆与构建鸡LIN28B基因表达载体，优化293FT细胞中的基因瞬时与稳定表达技术体系，大量获得外源目的蛋白，通过对6代cESC转录组测序以及不同抑制剂添加系统评价制约cESC细胞增殖的主要因素，进一步完善培养体系，使得cESC细胞体外传代突破6代制约，为大规模cESC的制备奠定基础。.重要结果与数据：.通过外源添加LIN28A、Nanog和POUV 3因子可将cESC培养至6代，而增加ALK5小分子抑制剂（Sox2激动剂）RepSox可将cESC培养至11代，其信号通路是激活了CDC 25A的表达上调，p16和p27明显下调，强化了细胞周期由G1期向S期转换，初步探明了制约体外培养cESC难于超过6代的分子机制。因此6代时的转录组测序已没有必要，但已经通过鸡单核巨噬细胞转录组测序建立了数据分析的LINUX和Hisat2+stringtie+ballgown的差异基因甄别平台，获得了7个差异表达基因。利用CRISPR/CAS9技术平台，选择Rosa26友好位点高效制备了稳定表达4因子细胞株，表达水平达7ug/ml以上，组建了新4因子（LIN28A、LIN28B、Nanog和POUV）培养体系，cESC细胞传代达到了12代，实现了质的飞跃。.科学意义：.cESC长期传代与大量扩增为细胞工程提供充足cESC资源，对研究胚胎发育、器官形成和生物反应器开发具有重要意义与应用价值。