模块化全集成核酸分析系统的技术研究

Integrated and automated nucleic acid analysis technology is a trend of molecular diagnosis. However, in the face of complex and diverse clinical test samples, existing integrated nucleic acid analysis systems face the following problems: sample processing and nucleic acid extraction procedures cannot be adjusted; the range of the handling volume of sample is small; the number and volume of reaction chambers cannot be adjusted with varying target demands. At present, there is not such a flexible fully integrated nucleic acid analysis system that can satisfy the detection of variable and complex samples. Therefore, the goal of this project is to build a modular microfluidic system to solve this issue. The cartridge we aim to construct can be divided into a sample pretreatment and nucleic acid extraction module, a valve and fluid driving module and a nucleic acid amplification module, which can be assembled for using. 1) The corresponding nucleic acid extraction module is selected based on requirement of different sample processing methods and different volumes of samples; 2) The corresponding nucleic acid amplification module is selected based on the number of detection targets and sensitivity requirement; 3) the valve and fluid driving module can be programmed versatilely. Our modular nucleic acid analysis system has great potential to elevate the flexibility and applicability of clinical sample analysis as well as reduce the operation cost and contamination risk. The system we aim to construct can work as a robust and convenient tool for molecular biology research and clinical applications.

集成自动化的核酸检测是分子诊断技术的发展趋势。但面对临床复杂多样的检验样品，现有的全集成核酸分析系统会遇到以下问题：样品处理和核酸提取流程不能变动，容纳的样品体积范围较小，反应孔的数量和体积不能针对指标需求变动。目前尚无能够灵活满足不同类型样品检测的全集成核酸分析系统，因此这就成为本课题的目标。本课题首次提出了一款模块化微流控卡盒设计思想，卡盒分为样品预处理和核酸提取、阀和流体驱动、核酸扩增三个可以组装的模块。1）针对不同类型样品的处理方式、体积差异选用不同样品预处理和核酸提取模块；2）根据不同的检测指标数量和灵敏度要求选用对应的核酸扩增模块；3）阀和流体驱动模块可以根据需要程序化控制流体运动。本课题拟构建的模块化核酸分析系统能够提高样品分析的灵活性和适用性，降低常规操作的繁琐性、杜绝样品和扩增产物的污染，为临床分子诊断技术的发展提供重要技术支持。

全集成自动化的核酸分析是分子诊断技术的发展趋势之一。本项目利用微流控技术，将常规实验室分区分步进行的核酸检测流程，集成在便携式微流控核酸分析系统上完成，以技术演进的方式构建了三款集成化核酸分析系统：.（1）构建了基于磁珠法核酸提取和环介导等温扩增（LAMP）的全集成核酸检测系统。该系统由全集成核酸分析卡盒和配套控制仪器组成，能够实现磁珠法核酸提取、分腔体的LAMP实时荧光检测。其中，全集成卡盒主要包含了流体驱动的注射泵、流路选通的旋转阀、反应液体的存储管和设有八个隔离反应腔的卡盒底座；卡盒控制仪器具有流体控制、磁珠操纵、恒温温控和单色荧光检测四个功能模块。该系统被成功应用于尿液和拭子样品中多种病原体“样品进-结果出”式的检测。.（2）构建了基于磁珠法核酸提取和聚合酶链式反应（PCR）的全集成核酸检测系统。该系统能够实现基于ChargeSwitch®的磁珠法核酸提取和双色荧光检测的竞争性等位基因特异性聚合酶链反应（KASP）。相比于前一款系统，本系统优化了卡盒结构设计与加工；采用热压阻塞管道的方式实现反应腔体之间的完全隔离；配套控制仪器增加了热阻断模块，构建了PCR温控模块和双色荧光检测模块。该系统能在三小时内自动化完成血液样品中七个遗传性耳聋相关突变位点的准确鉴定。.（3）构建了以模块化为主要特征的全集成核酸检测系统。相比上述系统，该系统的扩增检测采用了一种基于石蜡包埋和加热释放引物的多腔体PCR方案，并且将卡盒扩增反应单元与含有注射泵和旋转阀的流体操控主体分离，方便实现含有不同反应腔体的扩增模块与核酸提取模块的灵活组合。相应地，卡盒配套的控制仪器也进行了重新设计，以满足不同组合卡盒的检测需求。该系统同样被应用于遗传性耳聋相关突变位点的检测以初步验证系统的实用性。.综上所述，本项目从基于恒温扩增的病原体检出到基于PCR的遗传突变检测的需要出发，层次推进，构建并初步验证了三款便携式全集成核酸分析系统。课题支持发表包括Lab on a chip等微流控权威期刊论文9篇，授权发明专利3项，这些成果有望为未来核酸即时检测产品的开发提供重要技术支持。