基于MYT1L诱导因子的大脑周细胞重编程为胆碱能神经元及机制研究

Degeneration of cholinergic neurons contributed to the pathological process of neurodegenerative diseases. The emerging studies suggested that cell reprogramming will provide a new approach toward cell-based therapy of neurodegenerative diseases. Our pilot study found the potential role of reprogramming of brain pericytes (BrPCs) to cholinergic neurons by defined reprogramming factors or even the single reprogramming factor MYT1L. In the present project, we will focus on two folds as following: firstly, we set out to address optimization of the synergistic action of reprogramming factors, which directly drive BrPCs converted into functional cholinergic neurons; Secondly, the study designed to reveal the mechanism for direct reprogramming of BrPCs to cholinergic neurons. Our work will lay a foundation for chemical manipulation by using small molecules to reprogram the BrPCs to functional cholinergic neurons during clinical applications.

以胆碱能神经元损伤为病理基础的神经退行性疾病严重危害人类健康，临床尚缺乏有效治疗手段。体细胞重编程获取功能神经元及其分子机制是医学领域的重要科学问题。我们前期研究发现，以大脑周细胞为起始细胞可在几个神经元编程因子甚至单一因子MYT1L的诱导下转变为胆碱能神经元。在此基础上，本项目以诱导大脑周细胞体外重编程为可用于治疗的功能性胆碱能神经元为目标，拟开展以下研究：1）探索体外诱导大脑周细胞为胆碱能神经元的关键基因及其最佳诱导条件的重编程研究；2）诱导周细胞重编程获得功能性胆碱能神经元的分子调控机制研究。本项目将明确周细胞重编程为胆碱能神经元所需特定诱导条件，关键节点基因及相关分子调控机制，为后续开展小分子化合物诱导周细胞重编程提供研究基础，最终为治疗神经退行性疾病提供新思路。

以胆碱能神经元损伤为病理基础的神经退行性疾病严重危害人类健康，临床尚缺乏有效治疗手段。体细胞重编程获取功能神经元及其分子机制是医学领域的重要科学问题。在本项目中，我们评价了各重编程因子及其组合诱导周细胞重编程为神经元效果，考察了周细胞重编程所得细胞中神经元及胆碱能神经元标记物，推测诱导周细胞转变为胆碱能神经元的关键基因，并探索了重编程的初步机制。我们发现，1、重编程因子组合可诱导周细胞重编程为具有神经元形态和相关蛋白表达表型的细胞。重编程过程中，由周细胞形态转变为突触样形态的典型的神经元样表型。2、Myt1l单因子可能是周细胞重编程为神经元的关键因子，可重编程周细胞为胆碱能表型的神经元。Myt1l单因子组重编程效果与5重编程因子组（5Fs）所得细胞形态接近，呈胞体突起和突触细长等典型的神经元表型；两组细胞胆碱能神经元标志物ChAT/VachT 也均呈阳性表达。此外，Myt1l介导的周细胞重编程来源的神经元，可在神经元分支上观察到突棘样结构，提示所得到的神经元可能具有一定的突触可塑性。3、5Fs/ Myt1l诱导周细胞重编程为胆碱能神经元为主，暂未检测到多巴胺能和谷氨酸能神经元。4、Myt1l过表达可提高Ascl1、Ngn2和Brn2转录因子表达，其单因子的重编程效果可能经由提高这些因子表达进行。5、Myt1l介导的周细胞重编程为神经元样细胞为直接重编程。Myt1l病毒液侵染周细胞后，细胞增殖能力逐渐受到抑制，相对未侵染细胞（第10天），侵染细胞核内BrdU染色阴性，提示DNA合成停止，细胞增殖阻滞。这表明，Myt1l因子整合到周细胞染色体组后，随着表达量增加，逐渐改变周细胞原有增殖特性至停止增殖，启动神经元重编程，并直接转分化为神经元样细胞，或可用于神经元损失的替代细胞治疗。至此，本项目已初步明确周细胞重编程为胆碱能神经元所需特定诱导条件，关键节点基因及初步分子调控机制，为后续开展小分子化合物诱导周细胞重编程提供研究基础，最终为治疗神经退行性疾病提供新思路。