苦木药效物质基础β-卡波林生物碱对炎性信号传导通路的调控

苦木具清热解毒之功效，是多种清热消炎类中药复方的重要组方中药。但是，苦木抗炎的分子作用机制尚未阐明。申请人前期利用动物实验确证了苦木提取物的抗炎活性，并从中分离鉴定了48个单体化合物，新化合物20个。体外抗炎活性筛选表明β-卡波林生物碱具有较强的活性，能显著抑制LPS刺激巨噬细胞释放炎症因子TNF-α、IL-6以及炎性介质NO、PGE2。本课题拟通过LPS诱导体外炎症反应和体内炎症模型，深入研究β-卡波林生物碱的抗炎机制及对炎性信号传导通路的调控作用。荧光法检测iNOS酶活性；比色法检测COX-1/2酶活性；免疫蛋白印迹、RT-PCR法检测iNOS和COX-2蛋白、mRNA表达；免疫荧光、EMSA法检测β-卡波林生物碱对NF-κB、MAPKs炎性信号通路的影响。体内建立LPS致小鼠内毒血症模型，研究β-卡波林生物碱对LPS致内毒血症的预防和保护作用，阐明苦木发挥抗炎作用的分子机制。

1、对从苦木活性部位分离鉴定的48个单体化合物进行了体外抗炎活性筛选，部分化合物如1、7等对脂多糖诱导RAW 264.7细胞释放NO显示出很强的抑制活性；部分化合物如3、15等对脂多糖诱导RAW 264.7细胞释放TNF-α显示出很强的抑制活性；另外部分化合物如14-18等则对脂多糖诱导RAW 264.7细胞释放IL-6显示出很强的抑制活性。即多数β-卡波林型生物碱具有显著的体外抗炎活性。.2、25个β-卡波林型生物碱都具有共同的结构特点—C-14位双键的存在，其中，化合物7、14-17的C-14位为碳氧双键（醛基或酯基），化合物22、23的C-14位则为碳碳双键。表明C-14位的双键对β-卡波林型生物碱的抗炎活性至关重要。当C-14的碳氧双键（醛基或酯基）或者碳碳双键被还原为碳氧单键或者碳碳单键时，β-卡波林型生物碱原有的抗炎活性显著降低或者完全消失，甚至表现出细胞毒性。这表明C-14位的双键是β-卡波林型生物碱的活性基团。.3、11个双分子β-卡波林生物碱中，化合物34、35 和41的活性最强。这三个化合物相同的结构特点是C-14′位羰基的存在，这个特点和单分子β-卡波林生物碱C-14双键存在时才显示很强抑制活性的特点非常相似。表明C-14′位的羰基对双分子β-卡波林型生物碱的抗炎活性至关重要。.4、以三个活性最强的β-卡波林生物碱为例，阐明此类化合物的抗炎分子机制。结果表明β-卡波林生物碱对LPS诱导巨噬细胞释放 NO、TNF-α、IL-6 等炎症介质均有明显的抑制作用。荧光法实验结果表明β-卡波林生物碱对iNOS酶活性有明显的抑制作用，Western blot结果表明β-卡波林生物碱均能明显抑制iNOS蛋白高表达，但是对COX-2蛋白高表达无影响。. 通过以上研究阐明了中药苦木的药效物质基础和活性成分β-卡波林生物碱对炎性信号传导通路的调控作用机制，对推动中药的现代化研究、支持和指导苦木制剂的临床使用具有重要的实际意义。已培养硕士研究生2名，发表SCI学术论文3篇。