IRES调控EV71神经毒性的分子机理研究

IRES (Internal Ribosome Entry Site) plays a key role in modulating neurotoxicity after picornavirus infection. EV71 is second to poliovirus in neurotoxicity. However, the mechanism of this is still unknown. In our study, we will locate the mutation hot spots of the samples showed different clinical symptoms via UDPS (Ultra Deep Pyrosequencing), find the IRES mutation pattern in human population, and reveal the molecular mechanism of neurotoxicity caused by EV71 infection. By site-specific mutation and fragment replacement, we will construct a series of replicons and recombinant EV71 viruses containing differently mutated IRES. Then we will evaluate virus replication efficiency and host protein translation capacity in neuronal or non-neuronal cells, identify neurotoxicity-associated proteins, analyze the relationship between IRES mutation and neurotoxicity; we will also test the distribution pattern, pathological changes, and virus load of recombinant EV71 viruses in different organs in suckling mice. These will help us better understand the tissue tropism variation and the mechanism of the interaction between neurotoxicity-dominated sites and host immune system, thus unveil the mystery of neurotoxicity.

IRES在调节在小RNA病毒感染的神经毒性方面起着极其关键的作用，EV71 作为神经毒性仅次于脊髓灰质炎病毒的小RNA病毒科成员，其致神经毒性机理仍是个迷。在本研究中，我们将利用UDPS对不同临床症状的样品进行分析，确定IRES上的突变热点区域，找出IRES在群体内的突变规律，揭示EV71致神经毒性的分子基础。通过突变以及片段置换等技术，构建一组带有IRES上不同位点突变的复制子和重组病毒，在神经细胞和非神经细胞内检测不同的复制子和重组病毒对病毒复制效率、病毒和宿主蛋白翻译能力的影响，鉴定EV71 与神经毒性相关的蛋白, 解析IRES的突变与神经毒性变化的关系；利用动物感染实验测试不同的重组病毒在不同组织内的分布，病理变化以及不同组织内病毒载量的差异；比较不同重组病毒对宿主组织嗜性的变化，阐明EV71致神经毒性靶位点与宿主免疫系统相互作用，以及EV71 致神经毒性的分子机制。

IRES在调节在小RNA病毒感染的神经毒性方面起着极其关键的作用，EV71 作为神经毒性仅次于脊髓灰质炎病毒的小RNA病毒科成员，其致神经毒性机理仍是个迷。在本项目中，我们在前期工作的基础上，利用Ultra-deep pyrosequencing（UDPS）对EV71感染病人的临床样品进行分析，找到IRES在群体内突变规律，绘出突变的动态变化图，并利用生物信息学软件预测这些突变引起的IRES二级结构的变化；依据生物信息学分析结果，通过突变以及片段置换等分子生物学手段，在EV71感染性克隆上构建一组带有不同IRES突变位点的EV71复制子和重组病毒，在神经细胞和非神经细胞内验证这些突变对病毒复制效率以及病毒蛋白与宿主蛋白翻译能力的影响，确定IRES上影响神经毒性的突变位点和结构特征；在动物水平测试不同重组病毒在不同组织内的分布、病理变化，以及不同组织内病毒载量的差异；确定突变对病毒宿主组织嗜性的影响；探索EV71致神经毒性的靶位点与宿主免疫系统相互作用的关系，揭示EV71 致神经毒性的分子机理。.通过对不同临床症状样品的UDPS分析和生物信息学分析找到IRES上的突变热点区域及与之相对应的结构特征，筛选到一株能感染15日龄的小鼠的EV71强毒株。构建了EV71强毒株的感染性克隆的基础上，构建了IRES位点上不同位点突变的感染性克隆和复制子，通过将带有不同突变位点和/或结构特征的EV71 复制子和重组病毒转染或感染神经细胞和非神经细胞，分析其在不同类型细胞中的感染特征。结果发现多个氨基酸位点突变，结果显示EV71衣壳蛋白上的149位点氨基酸的突变对EV71神经毒性的至关重要。此结果和我们前期研究结果基本一致，进一步证实了IRES区的二级结构区域Loop 4以及VP1位点上关键氨基酸的突变与神经毒性有着非常重要的相关性。我们利用低神经毒性的EV71-HeN09株感染性克隆为模板，构建了一系列不同位点突变的EV71突变株，在细胞上拯救出病毒后，利用不同的突变株感染两周龄的幼鼠，根据感染小鼠的临床症状和死亡率鉴定出于EV71与神经毒性有关关键位点，结果显示EV71 VP1衣壳蛋白上的149位点氨基酸的突变对EV71神经毒性的至关重要。