抑制GCNT3逆转非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药的分子机制研究

GCNT3, regulating the formation of MUCIN, was identified to play significant role in EGFR-TKI drug resistance. Differential expression of mRNAs was screened through mRNA microarray between paired EGFR-TKI resistant NSCLC tumor tissues and adjacent normal tissues from the patients in Yunnan Xuanwei. We found that GCNT3 expression was significantly up-regulated in NSCLC tissue, and up-regulation of GCNT3 was related to poor prognosis of NSCLC patients. Knockdown of GCNT3 could down-regulate the expression of MUC5B, a kind of MUCIN, which certified that GCNT3 might participate in the formation of MUCIN and induce the EGFR-TKI drug resistance. However, the mechanism of GCNT3 induced cancer-promoting and drug resistance remains unclear. For this, we focused on GCNT3-induced drug resistance and its signaling pathways regulated by miR-302b-3p through miRIP, CHIP, RIP, Luciferase co-transfection, co-immunoprecipitation and molecular interactions methods to investigate the regulatory relationship between GCNT3 and EGFR-TKI resistance and also to identify the mechanism of EGFR-TKI resistance affected by GCNT3 expression. We hope that our findings would provide novel targets and biomarkers for the intervention, targeted therapy and prognosis of NSCLC.

GCNT3调控黏蛋白的合成，在EGFR-TKI耐药中扮演着重要角色。申请人前期工作中通过高通量转录组芯片检测宣威地区NSCLC EGFR-TKI耐药的癌和癌旁组织间基因的差异，发现GCNT3在癌组织表达显著上调并显示了患者的不良预后；敲低GCNT3可显著下调黏蛋白MUC5B，证实GCNT3参与了黏蛋白的合成并诱发了EGFR-TKI的耐药，但其促癌及耐药机制还不清楚。本课题将重点围绕GCNT3的促癌机制及其信号通路进行分析，通过miRIP、CHIP、RIP等筛选和鉴定miR-302b-3p调控GCNT3的信号通路，通过荧光素酶共转染、免疫共沉淀、分子相互作用等探讨GCNT3是如何通过miR-302b-3p调控网络，实现对EGFR-TKI耐药的调控，并探究其表达变化对EGFR-TKI耐药的分子机制，期望为NSCLC的靶向治疗和预后预测提供新的干预靶点和预测标志。

肺癌是高发病率、高死亡率的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）占85%，化疗为其主要的全身治疗手段，顺铂是最常用药物之一，但高发的耐药率阻碍了其临床应用。由黏蛋白合成酶GCNT3合成的黏蛋白MUC5B，在包括肺癌、胰腺癌、胃癌的增殖、迁移侵袭及预后中扮演了重要的角色。并且大量研究表明黏蛋白家族可能为化疗耐药潜在靶点，但与NSCLC发生顺铂化疗耐药是否相关未见报道。本研究前期基于临床患者组织样本，并通过体内外实验研究，发现在非小细胞肺癌尤其是肺腺癌中，GCNT3和MUC5B两者的高表达可促进NSCLC尤其LUAD中顺铂化疗的耐药性，且GCNT3能够影响MUC5B表达。提示黏蛋白合成可能与肺腺癌的顺铂耐药发生有关。尤其对于发生含顺铂化疗耐药的患者肺腺癌患者，MUC5B存在显著高表达，因此MUC5B的异常表达可能是顺铂化疗耐药的一个原因。并通过一系列细胞和动物实验发现敲低MUC5B可逆转顺铂化疗耐药。在机制研究方面，研究发现MUC5B可以增加核内β-catenin异常聚集，稳定胞内β-catenin水平，从而促进EMT过程，导致顺铂耐药。因此，可通过增强对黏蛋白MUC5B或GCNT3/MUC5B/β-catenin轴的抑制作用，增加非小细胞肺癌LUAD的顺铂化疗敏感性。基于此，我们在实验中也发现了通过顺铂与β-catenin抑制剂的联用可以致死顺铂耐药肺腺癌细胞，为化疗耐药的药物联用提供了理论依据。在免疫微环境探索方面，我们关注到了LUAD顺铂耐药肿瘤的形成伴随αβT细胞（CD4+ CD8+ MHCI- CD90+）的显著减少，MDSC细胞（CD11b+Gr1+）显著增加，说明肺腺癌顺铂耐药的形成过程中伴随着免疫抑制及肿瘤免疫微环境的改变。综合以上研究结果，我们证实了黏蛋白合成与肺腺癌顺铂化疗耐药的相关性，且为MUC5B作为未来临床顺铂化疗耐药参考标志物进行开发研究提供了一定的理论依据。