广枣总黄酮对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

经差速贴壁法培养新生大鼠心脏成纤维细胞(CFs) ，在体外建立血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导cFs增殖模型。采用四氮唑盐(MTT)比色法、3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法及流式细胞术测细胞增殖；3H-脯氨酸(Proline) 掺入法和羟脯氨酸比色法检测胶原合成；RT-PCR 测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA；Western blot测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白。观察一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)、鸟苷酸环化酶抑制剂(ODQ)及广枣总黄酮(TFFC)对AngⅡ诱导cFs增殖及胶原合成的影响。采用乳酸脱氢酶(LDH)活性测药物的细胞毒性；硝酸还原酶法测细胞培养液中一氧化氮(NO)水平；化学比色法测细胞培养液中一氧化氮合酶(NOS)水平；放免法测细胞内cGMP水平。从细胞水平阐明TFFC抑制心肌纤维化的分子生物学机制，为蒙药TFFC的开发和临床应用及心肌纤维化的防治提供新的研究思路和初步的实验依据。

心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)常伴随风湿性心脏病、高血压、心肌梗死及心力衰竭等多种心血管疾病，是多种常见心脏疾病向终末期心脏病发展的一个必然过程，是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键，防治MF的发生与进展已是目前治疗某些心血管疾病过程中，改善心脏功能并促进疾病愈复的重要环节。其中心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)是MF的主要效应细胞，其在刺激因素(心力衰竭、病毒性心肌炎、高血压、心肌梗死、糖尿病等)作用下的过度增殖和胶原合成增加在心血管的组织重构中起关键性作用，也是MF形成过程中的关键环节。蒙药广枣具有行气活血、养心安神功能，用于治疗气滞血淤、胸痹作痛、心悸气短、心神不安等心血管疾病，我们认为抑制MF很可能是广枣治疗这些心血管疾病的机制之一，为此我们从CFs为切入点，观察广枣有效成分广枣总黄酮(total flavones of fructus chorspondiatis,TFFC)对AngⅡ诱导的CFs增殖及胶原合成的干预效果并探讨NO-cGMP信号传导通路在其中的作用。首先，我们对广枣药材进行50%乙醇提取、HPD100大孔吸附树脂柱富集浓缩，制备了50%乙醇洗脱的总黄酮部位；通过紫外分光光度法对其中总黄酮含量进行了测定，以芦丁计，总黄酮含量为53.65 %并通过HPLC和LC-MS定性分析，综合样品中主要色谱峰的在线紫外全波长吸收图和准分子离子峰数据，以及文献提供的信息，指认50%乙醇洗脱物中的主要色谱峰为槲皮素的葡萄糖苷和金丝桃苷；之后，我们利用MTT比色法、3H-TdR掺入法及流式细胞仪检测了TFFC对AngⅡ诱导的CFs增殖的影响；利用3H- proline掺入法、羟脯氨酸比色法及RT-PCR法和Western blot法检测了TFFC对AngⅡ诱导的CFs I、Ⅲ型胶原 mRNA和蛋白表达的影响；最后，我们利用一氧化氮合酶抑制剂和鸟苷酸环化酶抑制剂检测了NO-cGMP信号通路在TFFC抑制AngⅡ诱导的心肌纤维化中的作用。项目研究基本按照计划任务书进行，通过3年多的努力，课题组已完成了原定计划，获得了一系列研究成果；首次发现蒙药广枣通过NO-cGMP信号通路抑制MF是其治疗心血管疾病的机制之一。