糖酵解在APC-Cdh1调控缺血后星形胶质细胞反应性增殖中的作用及机制

缺血性脑损伤后星形胶质细胞反应性增殖，影响神经功能恢复，研究显示通过抑制细胞周期进程，可以起到一定的脑保护作用。我们前期发现细胞周期末期促进复合物（APC）及其调节亚基Cdh1参与了缺血后星形胶质细胞增殖，但其具体机制尚不明确。近期研究显示，APC-Cdh1可以通过泛素化降解糖酵解的关键酶控制糖酵解，而糖酵解与细胞快速增殖有密切联系。本课题拟建立在体大鼠全脑缺血模型及离体星形胶质细胞缺血缺氧模型，观察糖酵解、线粒体氧化磷酸化及能量负荷的变化情况。采用分子克隆及RNAi 技术，通过GFAP特异性启动子在体及离体调控星形胶质细胞内APC-Cdh1活性，联合调控糖酵解关键酶活性，从形态学、生物化学、免疫学等方面探讨糖酵解在APC-Cdh1调控星形胶质细胞增殖中的作用及机制。本研究从糖酵解的角度，进一步探讨APC-Cdh1在中枢神经系统中的功能，为通过调控APC-Cdh1活性实现脑保护提供依据。

星形胶质细胞反应性增殖是多种中枢神经系统疾病的共有病理表现。研究表明，细胞异常增殖常伴随糖酵解的激活。PFKFB3是糖酵解关键酶PFK1的变构激活剂，可被APC-Cdh1泛素化降解。在可增殖细胞中，PFKFB3介导的糖酵解与细胞周期进程及细胞增殖密切相关，星形胶质细胞是可增殖细胞，因此，我们推断脑缺血后APC-Cdh1可能通过调控PFKFB3介导的糖酵解影响星形胶质细胞的反应性增殖。首先，本研究建立大鼠全脑缺血再灌注模型及星形胶质细胞氧糖剥夺再复氧模型，我们发现，缺血缺氧性损伤后星形胶质细胞发生反应性增殖而神经元出现凋亡，PFKFB3、PFK1表达及乳酸含量均增加，而Cdh1表达减少，提示脑缺血后星形胶质细胞反应性增殖伴随糖酵解的激活，Cdh1下调可能与该过程有关。通过构建PFK1过表达慢病毒、PFKFB3 siRNA，上调PFK1或下调PFKFB3的表达，我们发现：PFK1过表达慢病毒不影响正常星形胶质细胞的增殖，但可加剧OGD/R后星形胶质细胞的增殖及糖酵解的激活；PFKFB3 siRNA可抑制OGD/R后星形胶质细胞的增殖与糖酵解的激活。这表明调控糖酵解关键酶的表达，可调节OGD/R后星形胶质细胞的增殖。进一步构建Cdh1过表达和干扰慢病毒，上调或下调Cdh1的表达，我们发现：Cdh1过表达慢病毒可减少离体星形胶质细胞中PFKFB3、PFK1的表达及乳酸的释放，抑制星形胶质细胞增殖；在体实验证实，Cdh1过表达慢病毒可抑制脑缺血后神经元凋亡、糖酵解激活及星形胶质细胞增殖。反之，Cdh1干扰慢病毒加剧OGD/R后星形胶质细胞中PFKFB3表达的增加，联合使用PFKFB3 siRNA干预，可逆转该效应。其次，本研究还发现，Cdh1过表达慢病毒在体干预可抑制SnoN、Skp2的表达，减少CCNB1的积聚，减轻缺血性神经元凋亡。最后，我们采用脂多糖（LPS）模拟炎症反应刺激星形胶质细胞增殖发现，该过程与Cdh1及糖酵解无明显相关性，这表明并非所有因素引起的星形胶质细胞反应性增殖均伴随糖酵解激活。.综上所述，本研究表明：1，脑缺血后APC-Cdh1可通过调控PFKFB3介导的糖酵解影响星形胶质细胞的反应性增殖；2，APC-Cdh1可通过调控细胞周期相关蛋白影响脑缺血后神经元凋亡。这提示Cdh1与PFKFB3可成为治疗脑缺血的新靶点，并为探究神经系统损伤的治疗提供新思路。