相关代谢关键酶控制强化对木糖代谢酿酒酵母工程菌影响的研究

燃料乙醇由于其独特的"车用"属性而倍受新型能源领域的关注。以木质纤维素为原料是规模化生产、使用燃料乙醇的根本出路，其中亟待解决关键问题之一是纤维素中的各种糖分的有效转化。木糖在木质纤维素中的含量仅次于葡萄糖，但传统乙醇生产菌株酿酒酵母不能转化木糖。拓展酿酒酵母乙醇发酵底物的代谢工程是解决这一问题的基本途径，其研究现状是，已引入酿酒酵母的上游木糖还原酶和木糖醇脱氢酶但其辅酶不能偶联、下游木酮糖到乙醇代谢流不畅等致使木糖醇等副产物积累，糖醇转化率较低。本项目在改变木糖还原酶辅酶偏好性，建立氧化还原平衡的胞内环境的基础上，通过信息分析，推测各步反应的重要性，在建立不同表达体系基础上，对酿酒酵母木糖代谢途径中各酶促反应进行不同水平的强化，继而通过分析基因表达水平和糖醇转化率的内在关系，对相应的代谢调控问题提出定量的解释，从而为构建重组菌内和谐的木糖代谢环境提供理论依据, 促进相应的理性工业育种进程

年产量巨大的木质纤维素原料中含有约30%的木糖，其利用可带来巨大的经济效益。传统工业生产微生物酿酒酵母引入适当外源代谢途径即可利用木糖，但利用效率亟待加强，影响代谢效率的因素有待近一步揭示。本项目执行期间，研究了木糖到乙醇代谢途径中关键酶表达水平对代谢流的影响，根据任务书，超额完成原定研究计划，主要内容有：①在不同水平上强化木糖代谢途径中关键酶，界定木酮糖激酶表达水平高和过高的界限在0.16-0.20 U/mg 蛋白之间。证实磷酸戊糖途径的限速作用，并通过适应性进化筛选得到木糖乙醇转化率大幅度提高到0.39 g/g的进化菌株，相关工作发表在Metabolic Engineering及微生物学报；②建立了酿酒酵母高活性木糖异构酶高通量筛选技术平台，筛选获得在酿酒酵母中表达1.3U/mg活性的木糖异构酶，这是至今为止报道的第二例能在酿酒酵母中表达出高活性的木糖异构酶，此工作获得国家发明专利（ZL 201110042170.2），正在进行PCT程序进入美国和欧美。发酵条件优化后，该菌株木糖比利用速率达0.7g/g•h，乙醇得率可高达0.45 g/g，是已知最高木糖发酵糖醇转化率，相关工作已投稿Biotechnology Letters；③研究进化菌株转录水平变化，继而对变化基因进行功能验证，揭示了部分影响木糖代谢的节点，证实PFK27或PDC6的过表达都可提高重组菌株的木糖利用率，且过表达PDC6可显著降低甘油的生成。相关工作发表在Applied Microbiology and Biotechnology，审稿人认为该工作有较高的参考价值；④建立了酿酒酵母高效木糖运输蛋白的筛选平台，并得到木糖运输能力提高的蛋白，申请国家发明专利（201210007431.1，201110420908.4）并拟投稿Analytical Biochemistry；⑤在酿酒酵母中建立了独立于磷酸戊糖途径的从氧化起始的木糖代谢途径，类似工作尚未见报道。该重组菌株在木糖中比生长速率可达0.36 h-1，并呈现Crabtree-negative表型。该工作对以木糖利用及揭示Crabtree effect机制将有重要意义。相关工作已申请国家发明专利（201210088133.X），并已投稿Metabolic Engineering。