弓形虫嘧啶合成通路CSPII-ACT双基因敲除复制缺陷型疫苗的免疫效应及免疫保护机制研究

Toxoplasma gondiiis a worldwide spread opportunistic intracellular parasite whose infection has become a serious global public health issue. Once the key enzyme from the de novo pyrimidine biosynthesis pathway was knockout, the cellular proliferation of T. gondii would be notably repressed. In this study, we target to the Carbamoyl phosphate synthetase II (CSPII) and Aspartate carbamoyltransferase (ACT) genes of T. gondii, and plan to construct the CSPII-ACT double gene knockout strain via CRISPR/cas9 technique. The biological characteristics of the mutant strain will be studied by evaluating its virulence, stability, and the ability of invasion and cellular proliferation. Mice would be inoculated by the CSPII-ACT double gene knockout replication deficient strain, ROP5 DNA vaccine and SporoSAG protein vaccine individually or multiply. The induced immune effect and the immunological protection mechanism of the vaccines would be elucidated by detecting the level of humoral immunity and cellular immunity, doing the adoptive immunity test, analyzing the T cell subset and carrying out T. gondii-challenging experiments. Then we applied this optimal immune procedure on cats to further explore the effect and feasibility on anti-toxoplasmosis. The implementation of this study is of great significance to the effective prevention of toxoplasma infection and control of toxoplasmosis.

弓形虫是广泛分布的机会性致病原虫，其感染已成为严重的世界性公共卫生问题。弓形虫嘧啶合成通路关键酶的缺失能有效阻止虫体的胞内增殖。本研究拟以嘧啶合成途径中的氨基甲酰磷酸合成酶II（CSPII）和天冬氨酸转氨甲酰酶（ACT）为靶点，通过CRISPR技术构建弓形虫CSPII-ACT双基因缺陷株，并研究其稳定性、入侵和增殖能力以及毒力等生物学特性；将弓形虫CSPII-ACT双基因敲除复制缺陷株、棒状体ROP5 DNA疫苗、子孢子表面抗原SporoSAG蛋白疫苗单独和联合免疫，通过体液免疫、细胞免疫、过继免疫、细胞亚群分析、攻毒保护实验等研究诱导的免疫保护力与免疫机制，探明弓形虫CSPII-ACT双基因敲除复制缺陷型疫苗的有效性；并以优化的联合免疫程序免疫实验猫，进一步分析作为猫用弓形虫疫苗的效应与机制。本项目的实施对有效预防弓形虫病、控制弓形虫病的流行具有重要意义。

弓形虫是广泛分布的机会性致病原虫，其感染已成为严重的世界性公共卫生问题。弓形虫嘧啶合成通路关键酶的缺失能有效阻止虫体的胞内增殖。本研究拟以嘧啶合成途径中的关键基因为靶点，通过CRISPR技术构建弓形虫基因缺失株，并研究其生物学特性，通过体液免疫、细胞免疫、过继免疫、细胞亚群分析、攻毒保护等实验，探明弓形虫基因敲除复制缺陷型疫苗的有效性及相关机制。研究成功获得了缺失ompdc和uprt基因的弓形虫虫株，体外噬斑实验和胞内增殖实验证实其胞内增殖水平的显著降低，体内小鼠感染实验（包括正常小鼠及免疫低下小鼠）确认毒力的显著下降，感染后不引起小鼠的死亡；将该虫株免疫BALB/c小鼠后，诱导产生了强烈的体液免疫和细胞免疫水平，包括IgG1和IgG2a抗体的显著上升，CD4+ 和CD8+ T细胞数目的显著增加，以及主要炎症细胞因子（IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-10、IL-4）的显著上调；攻击感染强毒株RH株、弱毒株ME49株和中国本地株WH6后均未引起小鼠的死亡，组织切片也未观察到明显的病理变化，诱导产生的免疫反应对弓形虫的保护力为100%；通过阳性血清、淋巴细胞、B细胞、CD4+ 和CD8+ T细胞的过继免疫保护性实验发现，除免疫CD4+ T细胞的小鼠外，其他小鼠的存活时间均得到了显著的延长，表明阳性血清、淋巴细胞、B细胞、CD8+ T细胞都在一定程度上发挥了抗弓形虫感染的作用；进一步将虫株通过肌肉注射免疫猫，诱导了IgG抗体及主要炎性细胞因子IL-2、IFN-γ的显著上调；免疫2次后经口感染弓形虫ME49包囊，收集感染后1-14天的猫粪便进行卵囊计数，结果发现免疫组的卵囊数量显著低于对照组，总减囊率达到95.3%，卵囊排放时间也少于对照组，表明虫株对于终末宿主提供了有效的保护力。以上研究成果对于最终研制并推广猫用的减毒活疫苗提供了理论及实践支撑，对有效切断弓形虫病的传播、预防和控制弓形虫病的流行具有重要意义。