RG5调控水稻籽粒大小的分子机理及育种利用

In this application, the round grain mutant rg5 (round grain on choromosome 5) with increased 1000-grain weight was identified from EMS mutagenesis population of Yundao32. By the 1048 homozygous individuals of BC1F2 population, the gene was fine mapped in an interval of 85kb, and a switch of C to G which resulted in a substitution of Arg to Gly which was found in the tenth ORFs. The candidate gene is an unreported new gene in regulating grain size and predicted to encode a transcription factor. On the basis, we will carry out the study to further conduct the RG5 gene function analysis to ascertain the molecular mechanism and enrich the gene regulatory network of grain size by the experiments of the gene function complementation, over expression, CRISPR-Cas9 knock-out, GUS, GFP, fluorescent in Situ Hybridization, RNA-seq analysis, Chip-seq analysis, yeast library screening and double mutant analysis combined with the qRT-PCR, Western, yeast one-hybrid and yeast two-hybrid system, BiFC and pull down test on the level of the phenotype, fluorescent, cDNA, and protein. Meanwhile, we will also identify the elite allelic variation of RG5, elevate its production and application potential, and create the new breeding varieties by the gene pyramiding with yield gene.

本申请从云稻32的EMS诱变体库中鉴定出一个能够增加千粒重的圆粒突变体rg5（round grain on choromosome 5），并利用BC1F2群体将该基因精细定位在85kb的区间内，通过测序发现其中第10个开放阅读框发生了一个C至G的单碱基替换，造成一个精氨酸转变为甘氨酸。该候选基因为一个未报道的粒形新基因，预测编码一个转录因子。在此基础上，拟进一步开展基因的功能互补、过表达、CRISPR-Cas9敲除、GUS、GFP、原位杂交、RNA-seq、ChIP-seq、酵母筛库及双突分析等，并结合定量PCR、Western、酵母单杂和双杂、体内BiFC和体外pull down验证，在表型、荧光、cDNA、转录组及蛋白水平上对基因功能进行多重研究，以解析RG5的分子作用机制，丰富水稻粒形的基因调控网络，同时挖掘RG5的有利等位型，评估其生产应用潜力，通过聚合产量基因创制水稻育种新材料。

水稻是一种重要的禾谷类作物，养活了世界近一半的人口。确保水稻的高产稳产一直是育种学家的研究重点。水稻的产量主要由有效穗数、每穗粒数和千粒重三要素决定。其中，籽粒的形态直接决定着千粒重的大小。本项目以一个可增加千粒重的圆粒突变体RG5为研究材料，在前期精细定位85kb的基础上，进一步克隆了该基因。RG5编码一个AP2家族转录因子，具有转录激活功能，其R2结构域会抑制转录活性。该基因主要在幼嫩的茎和穗中表达，亚细胞定位表明其位于细胞核中。此外，过表达该基因可增加粒长，敲除则增加粒宽。扫描电镜和石蜡切片分析发现，RG5主要是通过促进细胞增殖和扩张来调控株高和籽粒大小。通过筛选酵母文库，我们发现RG5与5个G蛋白γ亚基均互作，包括两个常规的Gγ亚基基因RGG1和RGG2和三个非典型Gγ亚基基因GS3、DEP1和OsGGC2。G蛋白复合物在信号途径中起分子开关作用，其在水稻的成员均涉及调控株高和粒形。遗传分析发现rgg2/rg5和dep1/rg5的双突变体均表现为rg5的矮化圆粒，且RG5-OE能大部分恢复rgg2和dep1的突变表型，而RGG2-OE和DEP1-OE不能恢复rg5的表型，表明RG5作用于G蛋白的下游。此外，我们通过DAP-seq找到了RG5的下游靶基因DEP2，DEP3，DRW1和CyCD5;2，并通过酵母单杂、EMSA、荧光素酶活性和Chip-PCR确定了RG5调控这些基因的启动子区域及主要结合基序。同时我们还发现RG5可分别与RGG2或DEP1一起促进转录活性，并增加下游基因的表达。这些遗传和生化证据表明，RG5是通过与Gγ亚基互作调控下游靶基因DEP2、DEP3、DRW1和CyCD5;2的转录来调控株高和籽粒大小。我们的研究结果丰富了水稻粒形的遗传调控网络，为进一步的水稻高产育种打了理论基础。