两个家系Brugada综合征SCN5A基因新突变的功能表达研究

Brugada syndrome (BrS) is an ion-channel-typed autosomal dominant disease. It has been known that if the mutation of gene SCN5A which encodes cardiac sodium channel appeared, it would flaw their function, And that will also cause the occurrence of Brugada syndrome. The previous research team found new six mutation sites in the SCN5A gene . Based on this point, this study would prepare to screen the studying.sites occurred in the area of mutation sites located in protein-functional region of SCN5A by the way of forcasting the proteins’ three dimensional structure; also to construct the pRc/CMV- hHl recombinant vector carrying SCN5A gene mutation sites via using a large primer and PCR site-directed mutagenesis method; Let the mutant and wild-type recombinant vector transfect the stably expressed pGFP-IRES-h1 plasmid 293 cell lines using liposome -mediated methods, then these would be screened and identified by G418; this study would also respectively detect the mutant and wild-type cells’ SCN5A genes expression changes at the levels of mRNA and protein, then to apply the whole-cell patch-clamp technique to record the current signal released by sodium channel, as the result, this could confirm that the mutation can cause sodium channel’s electrophysiological characteristics changed and lead to the disease. It will provide the objective bases for the further study of ions , cell electrophysiological mechanisms realtated with Brugada syndrome.

Brugada综合征(BrS)是一种离子通道型的常染色体显性遗传疾病。已知编码心脏钠离子通道的SCN5A基因如果出现突变及功能缺失会引Brugada 综合征的发生。课题组前期通过对两个Brugada综合征家系血样的研究，在SCN5A基因上发现6处新的突变位点。基于此，本研究拟通过蛋白质三维结构预测，筛选发生于SCN5A蛋白功能区域的突变位点为研究位点，采用大引物PCR定点诱变法，构建携带有SCN5A基因突变位点的pRc/CMV-hHl重组载体，并将突变型与野生型重组载体采用脂质体介导的方式转染稳定表达pGFP-IRES-h1质粒的293细胞系，并用G418进行筛选鉴定。然后分别检测突变型与野生型细胞SCN5A基因在mRNA和蛋白表达水平的变化，并采用全细胞膜片钳技术记录钠通道电流，证实该突变能够引起钠通道电生理特征发生改变并致病，为一步研究Brugada综合征的发病机制提供理论依据。

Brugada综合征(BrS)是一种离子通道型的常染色体显性遗传疾病，具有心电图表现为右胸导联V1、V3持续性ST段抬高和高心源性猝死 (sudden cardiac death，SCD)风险特征。在BrS患者中，致病突变不仅存在于SCN5A中，还存在于编码Nav1.5修饰蛋白的基因中，导致INa功能缺失。在修饰蛋白中，不形成离子传导孔的Navβ3通过调节通道门控特性，增加细胞表面Nav1.5的表达，从而改变Nav1.5的功能。课题组在前期研究中收集了一个家系中发病的BrS患者的外周血，通过基因检测发现其SCN3B基因目标位点c.260存在杂合变异。基于此，本研究借助重编程技术，利用BrS患者PBMCs成功构建具有全能性且不含外源性基因的iPSCs；采用时序性短暂激活/短暂抑制Wnt信号通路的方法，将未分化的BrS-iPSCs定向诱导分化为心肌细胞。采用膜片钳实验研究SCN3B突变所致BrS对Nav1.5动力学及动作电位的潜在影响，研究结果显示，SCN3B突变所致BrS使内向钠电流密度显著减小（control组 -68.31±10.97 pA/pF和BrS组 -26.71±6.07 pA/pF）（P<0.05）；Nav1.5通道激活曲线右移（对照组V1/2=-43.99±1.52 mV和突变组V1/2=-41.42±1.66 mV），失活曲线右移(对照组V1/2=-65.80±0.58mV和Brugada组V1/2=-63.91±0.49mV)但均无显著性差异（P>0.05）。与对照组相比，失活恢复时间常数增大，其中慢成分存在显著性差异。此外，自发条件下，BrS组动作电位VMax、APA显著减小；给予一定刺激诱发，0.5Hz与1Hz条件下，BrS组APA减小，APD90增加，且均存在显著性差异（P<0.05），APD50无显著性变化（P>0.05），而APD30显著减小且存在统计学差异（P<0.05），特定频率或自发节律下，MDP均无明显变化（P>0.05）。分子生物学研究发现，BrS组SCN3B mRNA表达显著低于对照组，BrS组SCN3B蛋白表达亦显著低于对照组（P<0.05）。因此，通过本研究证实，SCN3Bc.260突变可导致钠通道功能降低和SCN3B基因蛋白及mRNA表达的差异，从而参与了该患者BrS的发病。