醌还原菌对固态水溶性醌介体强化难降解有机物厌氧生物转化的响应机制

为充分发挥固态水溶性醌介体加速难降解有机物厌氧生物还原转化的作用，本项目拟从分子水平上揭示醌还原菌对固态水溶性醌介体的响应机制。以共价固定在聚氨酯泡沫（PUF）上的蒽醌-2-磺酸（AQS-PUF）为氧化还原介体，以偶氮染料为目标污染物，以E.coli K12为模式菌株，研究E.coli K12还原AQS-PUF的特性。并在此基础上，采用DNA微阵列技术，辅以实时RT-PCR，全面筛选由AQS-PUF引起差异表达的上调基因，并初步判定其中的关键基因。进一步通过基因敲除、过量表达等分子生物学手段，重点研究与细胞膜和外周胞质相关的关键基因功能及其在AQS-PUF生物还原过程中的角色，从而解析AQS-PUF生物还原的主要电子传递途径。通过上述研究，本项目不仅为固定化醌技术的应用提供理论基础，并且对深入理解固态水溶性醌介体促进难降解有机物生物转化的本质具有重要意义。

为充分发挥固态水溶性醌介体加速难降解有机物厌氧生物还原的作用，本项目以共价固定在聚氨酯泡沫上的蒽醌-2-磺酸（AQS-PUF）为氧化还原介体，以偶氮染料为目标污染物，以E. coli K12为模式菌株，首先优化了E. coli K12还原AQS-PUF的条件。研究表明，在最适条件下，AQS-PUF能够有效地加速E. coli K12还原多种偶氮染料。固定在PUF上的AQS最大量为100 μmol/g。此外，采用吸附/共价偶合和共价的方法可将AQS分别固定在多孔陶粒表面和涤纶滤布上，固定的AQS最大量分别为2.3 μmol/g和60 μmol/g。这三种固定化醌都具有良好地催化性能，并且能够重复使用。综合考虑，微阵列实验选用醌基纤维布作为固定化醌。采用DNA微阵列技术，全面调查了E. coli K12的转录组对醌基纤维布（AQSim）还原和偶氮染料酸性红18（AR18）脱色的响应，并采用定量RT-PCR，验证了转录组数据。结果表明，AQSim比AR18更易被E. coli K12接受。虽然在AQSim/ AR 18和AQSso/ AR 18，AQSim和AR 18之间有些不同，但大肠杆菌对这四个过程的响应存在更多的相似性。在60%以上的共享基因中，编码末端还原酶，甲萘醌生物合成，甲酸脱氢酶（fdhF）和外膜蛋白在内的几组基因显示了高水平地表达。进一步的基因敲除实验表明，fdhF，nrfABCD, frdBCD 和dsmABC基因参与了AQSim的还原和AR 18脱色。基于此，我们提出了在大肠杆菌体内AQSim还原和AR18脱色的主要电子传递途径：葡萄糖作为电子供体被代谢为甲酸；然后甲酸脱氢酶将电子传递给甲萘醌；NrfABCD，DmsABC和 FrdBCD再将电子从甲萘醌传递给外膜蛋白或电子载体；最后在细胞外还原AQSim 和AR18。此外，我们也观察到了与环境压力响应基因的上调，它表明大肠杆菌对AQSim和AR 18暴露的适应。上述研究不仅为固定化醌技术的应用及进一步研究醌还原菌能力差异的机制提供理论基础，并且对深入理解固态水溶性醌介体促进难降解有机物生物转化的本质具有重要意义。