通过蛋白表达差异与动态组成研究绵羊双羔性状的信号分子及其调控机理

Lambing performance of sheep is the most important economic trait and is regarded as a critic factor affecting the productivity in sheep industry, in which the twinning trait is regarded as the ideal lambing performance favoring by sheep industry. In the present study, based on the analysis of major genes of sheep multiple lambs and human twinning genes reported previously, using methods and techniques of proteomics, genomics, biochemistry, cell immunology, and productive endocrinology, we firstly investigate protein expression level and dynamic components of ovary tissues at different ovulation ratio of sheep breeds at same age.The breeding ewes will be studied including Mongolia ewes , Small Tail Han ewes, and Poll Dorset ewes with different lambing performance (e.g. multiples, twins, and singletons) at the different developmental stages of follicle cell during oestrous and non-oestrous cycle; then, we detect functional proteins that display distinct expression level and dynamic composing in corresponding stages, analyze expression distribution, variation rule, subcellular localization, and nucleotide variation and polymorphism of their encoding genes, confirm their regulating paths, interacted signaling molecules, and interacting patterns and targeting sites involved in sheep follicle developing, and test hormone secretion level and changes during different developmental stages of sheep follicle; finally, we try to disclose and clarify mechanisms of molecular genetics and regulation for controlling sheep twinning traits, and support important theoretical and practical basis for improving fine sheep twinning traits.

绵羊的产羔性能是养羊业中影响生产效率最重要的经济性状，其中双羔性状是养羊业实际生产中追求的最理想产羔性状。本研究在分析已经报道的绵羊多胎主效基因和人双胞基因的基础上，利用蛋白质组学、基因组学、生物化学、细胞免疫学及生殖分泌学方法研究在相同饲养管理条件下同龄已有产羔记录的蒙古羊（单胎母羊和双胎母羊）、无角陶赛特羊（单胎母羊和双胎母羊）、小尾寒羊（多胎母羊）分别在绵羊非发情季节和发情季节发情周期卵泡不同发育阶段卵巢组织中的蛋白质表达水平差异和动态组成变化，检测相应时期表达水平与动态组成具有差异的功能蛋白，分析其编码基因的表达分布、变化规律、亚细胞定位以及核酸变异与多态性，确定其参与绵羊卵泡发育的调控途径和相互作用的信号分子及其互作方式与作用靶点，同时测定绵羊卵泡不同发育时期相关生殖激素分泌水平与变化，揭示和阐明绵羊双羔性状的分子遗传机制和调控机理，为养羊业中选育双羔性状提供理论基础和实践依据。

绵羊双羔性状的选育是目前我国养羊业生产中急需解决的一个难题。本项目对TCA/丙酮沉淀法和直接裂解法提取绵羊卵巢组织全蛋白方法进行了比较、筛选与优化，建立了最适绵羊卵巢全蛋白提取方法；利用双向凝胶电泳结合生物质谱技术，开展了产单羔蒙古羊、产双羔蒙古羊、产单羔无角陶赛特羊、产双羔无角陶赛特羊和产多羔小尾寒羊3个绵羊品种的繁殖母羊分别在乏情期（4月份）、发情季节（9-11月份）发情周期第1天和第11天卵巢组织蛋白质组的研究，检测分析了不同产羔性状母羊在繁殖周期中卵泡不同发育阶段卵巢组织蛋白质动态组成及含量变化规律和差异表达蛋白，获得不同产羔性状母羊在繁殖周期中卵泡不同发育阶段卵巢组织蛋白质表达图谱和筛选出与产羔性状相关的27种差异表达蛋白；并对差异表达蛋白进行亚细胞定位，同时对差异蛋白质进行GO分析以及 KEGG 通路分析，构建了差异蛋白质相互作用网络，进一步筛选出与绵羊产羔性状相关的关键蛋白：BMPR-1B、GDF9、 MTHFR、 Calmodulin、和 SOD-[Cu-Zn]-like蛋白，为进一步研究双羔性状的机理和调控机制奠定了基础；用RT-qPCR方法检测分析了不同产羔性状繁殖母羊在繁殖周期不同时期时卵巢、垂体、下丘脑中BMPR-IB、GDF9、RXRG 3个基因mRNA表达水平及其变化规律，用RT-PCR、PCR-SSCP、DNA测序等技术初步检测分析了的BMPR-IB、GDF9和RXRG 3个基因CDS序列的SNPs及其与双羔性状的相关性，同时用不同产羔性状繁殖母羊的共有差异表达蛋白质BMPR-IB蛋白的基因，构建原核表达载体并表达，获得重组蛋白，并用其免疫小鼠，获得多克隆抗体，用免疫共沉淀方法与质谱分析的方法筛选鉴定出BMPR-1B蛋白的5种相互作用蛋白，并进行生物信息学分析，初步揭示了BMPR-1B基因在绵羊繁殖性状方面的信号传导机理，分析了BMPR-IB蛋白对绵羊产羔性状的分子调控作用。同时，通过放射免疫等方法测定了三个品种绵羊分别在乏情期和发情季节发情周期中不同时期外周血液中激素的变化，分析了生殖激素水平调控绵羊双羔性状的分子机理。为进一步揭示绵羊双羔性状的分子作用机理和调控机制提供了基础理论依据和资料。