绵羊新多胎（多羔）主效基因鉴定及其调控作用机制

The economic value of improving litter size of sheep is great.Genetic studies on sheep prolificacy have suggested that litter size can be determine by the action of a single major gene, and the major gene is differed from different breeds. It is unclear which major gene affects prolificacy in East Florida sheep.The mutations of major genes associated with high prolificacy were not found in East Florida rose sheep. Then, the presence of a novel major gene was hypothesized in East Florida sheep. Based on the preliminary study, it will be performed SNP Genotyping using the Illumina Ovine SNP680 to screen a novel major gene associated with high prolificacy in sheep, identified by genome-wide associated studies (GWAS) and CRISPR/Cas9. The function of mutant in the novel major gene will be analyzed by dual- luciferase reporter assay system. The mechanism of this major gene affecting litter size will be illuminated through the expression pattern during follicular development. The novel major gene found in East Florida sheep will be possible to accelerate breeding programs in sheep.

绵羊产羔数是重要的经济性状。绵羊多胎表型由主效基因控制，各绵羊品种呈现主效基因有所不同，东佛里升绵羊具有较高繁殖力，但是多胎主效基因尚不清楚。已有研究表明东佛里升绵羊可能存在新的多胎主效基因与作用机制。本研究以前期东佛里升绵羊的研究为基础，应用绵羊680K SNP芯片检测全基因组SNP标记、全基因组关联分析结合CRISPR/Cas9基因编辑技术等手段，筛选与鉴定多胎主效基因；采用荧光素酶表达系统分析突变位点对主效基因功能的影响；分析主效基因在卵巢中表达模式及对卵泡发育影响，揭示多胎主效基因的作用机制。东佛里升绵羊多胎主效基因的分子标记育种，对加快绵羊多胎品系的遗传进展具有重要的实践意义。

绵羊高效育种手段对羊肉生产至关重要，产羔数是低遗传力性状，利用多羔标记实现早期选择，提高高繁殖力绵羊选育准确性并缩短培育周期，是提高母羊繁殖力有效育种手段。绵羊多羔表型由主效基因控制，各绵羊品种主效基因有所不同，东弗里升绵羊具有较高繁殖力，但是多羔主效基因尚不清楚。本项目采用基因组重测序与全基因组关联分析，筛选与鉴定与东弗里升绵羊产羔数关联的SNP位点，获得3个达到全基因组建议显著水平的SNP位点，分别是rs413468688、rs400952839和chr2:8283097，其中chr2:8283097位点显著性最高，并且通过大群体遗传验证，确定chr2:8283097位点T-A突变，增加了绵羊产羔数。进一步研究发现该位点及附近并不存在功能编码基因，扩大筛选距离，距该位点下游约356kb定位到一个编码基因TNC。通过对表达谱数据库分析，TNC基因主要在绵羊乳腺和子宫表达，推测其可能调控子宫容受性影响产羔数。为了确定该假设，在体外建立了绵羊子宫模型，分离子宫内膜上皮和基质细胞，并通过SV40T转化成细胞系，保障了两种细胞增殖能力，上皮和基质细胞系体外传代培养分别达到50和30代以上。利用两种细胞、基质胶和滋养层细胞类胚球体构建了3D培养体系，模型早期胚胎附植过程。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将子宫上皮细胞TNC基因进行敲除，获得TNC功能缺失的上皮细胞系。加入类胚胎样球体测定其粘附率，发现TNC-/-上皮细胞对类胚胎样球体的粘附率显著高于野生型细胞，表明TNC通过抑制胚胎的粘附来抑制绵羊的胚胎附植过程，导致成功着床的胚胎数减少，最终致使产羔数降低。高产羔数新遗传标记与主效基因的鉴定，丰富了绵羊高繁殖力遗传机制理论，对高繁殖力绵羊新品种选育提供了理论和技术支撑。