Vibralactone生物合成中碳骨架生源确定和异戊烯基转移酶的研究

申请者所在的国家重点室研究人员从褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)中分离鉴定了韧革菌素(vibralactone)，该化合物结构新颖，对胰脂肪酶有很强的抑制活性，具有很好的药物研发前景。韧革菌素的生物合成途径新颖而独特，根据前期同位素饲喂结果推测：韧革菌素内酯环碳骨架可能来自赖氨酸或者其生物合成过程中的中间体，通过环化、异戊烯转移酶、酰基转移酶、氧化、脱羧等催化反应后形成韧革菌素。本项目拟以韧革菌素为研究目标，通过13C标记的同位素饲喂，明确生物合成中韧革菌素内酯环的碳来源；通过构建褐盖韧革菌的基因组粘粒文库、杂交筛选、高通量测序、基因克隆、生化鉴定等技术方法，研究韧革菌素生物合成中异戊烯基转移酶的生物学功能，并阐明异戊烯基转移酶在韧革菌素生物合成中的催化功能和机制。该研究可能在高等担子菌的次生代谢产物研究中获得开创性突破，为进一步的遗传工程向改造代谢途径提供依据。

通过同位素饲喂、韧革菌素代谢谱和 cell-free体外酶促的实验发现了韧革菌素双环内酯骨架既不是聚酮也不是倍半萜来源，而是来源于莽草酸途径的对羟基苯甲酸：通过饲喂13C同位素标记的醋酸钠确定异戊烯基来自甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway)的乙酰辅酶 A；而通过饲喂13C同位素标记的赖氨酸、葡萄糖、甘油、苯丙氨酸和对羟基苯甲酸确定韧革菌素的直接前体为对羟基苯甲酸；韧革菌素代谢谱和 cell-free体外酶促揭示五四双环的内酯环是通过苯环扩环以及中间体七元内酯环在分子内形成C-C环化而成。 通过基因组部分序列分析，克隆到了异戊烯基转移酶基因vibPT全长和cDNA序列。对异戊烯基转移酶基因进行RNAi实验，并通过异源表达证明异戊烯基转移酶基因参与了韧革菌素生物合成途径中异戊烯基转移酶的，在体外实验中发现vibPT的最适温度为32 oC，pH为7.5，不同金属离子中Ca2+，Mg2+和Mn2+对vibPT活性有一定的促进作用，而Zn2+和Cu2+ 有较明显的抑制作用。期间发表SCI研究论文9篇，培养研究生2名。