Glycodelin蛋白对黑素瘤局部T细胞的免疫抑制作用研究

Glycodelin蛋白是妊娠早期对抑制母体免疫和促进胚胎植入起关键作用的一个淋巴细胞功能调节分子。我们近期报告了glycodelin基因在恶性黑素瘤高水平表达，并促进肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭。鉴于肿瘤侵蚀和胚胎植入过程的相似性，我们推测黑素瘤细胞通过合成和分泌过量的glycodelin蛋白抑制淋巴细胞的免疫功能，诱导产生局部免疫耐受，使得肿瘤逃脱免疫杀伤并得以生长和转移。T淋巴细胞介导的细胞杀伤在黑素瘤肿瘤免疫中处于核心地位，本研究将着重探讨glycodelin蛋白对T细胞的免疫抑制作用：利用细胞模型检测glycodelin蛋白对T细胞活化、增殖、凋亡和特异性杀伤功能的影响；利用免疫重建动物模型对体外结果进行验证；同时分析glycodelin蛋白的糖基部分，确定其亚型。以上研究对阐明肿瘤局部免疫耐受形成的机制具有重要意义，将为控制肿瘤生长、探索更好的免疫新疗法奠定基础。

恶性黑素瘤是皮肤黑素细胞系统所发生的恶性程度最高的肿瘤之一。尽管近年来生物科学在各个领域迅猛发展，黑素瘤的临床治疗手段却没有根本的改进，死亡病例高达皮肤癌所致死亡的80％，因此深入分析黑素瘤的发病机制，探索有效的治疗方案非常重要。本研究拟对Glycodelin促肿瘤发展的免疫机制进行分析和探索。.Glycodelin最早是从人类胎盘、羊水、怀孕期子宫蜕膜中发现并分离出的一种糖蛋白。根据人类基因组计划基因命名委员会（Gene NomenclatureCommittee）的建议，将glycodelin 的多个名称统一命名为 PAEP（progestagen-associated endometrial protein）。以下叙述均采用PAEP代替glycodelin。大量的研究表明，它能够抑制T细胞的免疫活性，对妊娠期母体免疫耐受的建立和HLA半相合胚胎植入起重要的调节作用。我们以往的研究发现PAEP基因在恶性黑素瘤组织和及体外培养的细胞系中高水平表达，对肿瘤细胞的迁移侵袭具有促进作用。鉴于肿瘤侵袭和胚胎植入的相似性，我们推测存在这种可能：高表达的PAEP对T细胞具有负性调节作用，使得肿瘤细胞逃脱了免疫细胞的监视和杀伤而迅速发生浸润转移。.为了证明这个假设，我们从以下三方面进行了研究：1. 采用RT-PCR和Western blot检测PAEP在黑素瘤细胞系中的表达；2. 利用PAEP siRNA和shRNA重组慢病毒感染肿瘤细胞，下调PAEP的表达并获得PAEP表达抑制的稳定细胞系，为下一步实验提供蛋白样品及细胞模型；3. 分离人外周血单个核细胞及纯化的CD8+ T细胞，分别将PAEP蛋白或PAEP表达抑制的肿瘤细胞与淋巴细胞混合，与对照组相比观察淋巴细胞的增殖、凋亡和肿瘤杀伤功能的变化。实验结果显示：1. 分别从mRNA和蛋白水平证实了PAEP基因在黑素瘤细胞系的表达；2. PAEP siRNA显著降低了PAEP mRNA的表达；通过慢病毒转染获得了PAEP表达抑制的稳定细胞系；3. PAEP条件培养上清加入体外活化的淋巴细胞后，细胞增殖明显变慢，细胞凋亡比例增加；4. 经PAEP表达抑制的肿瘤细胞诱导的效应淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤率明显高于对照组。体外实验表明PAEP蛋白抑制淋巴细胞增殖和细胞毒作用，增殖抑制作用可能由促凋亡引起。