NLRC5受体对猪萨佩罗病毒诱导猪小肠上皮细胞I型IFN产生的影响及机制初探

NLRC5NLR (family, CARD domain containing 5), a recently identified NLRs family member with role in immune regulation. It has been confirmed that NLRC5 can regulate the type I IFN producing pathways significantly and play an important role in anti-pathogen innate immune in a variety of cell types of the human and mouse. However, the role of NLRC5 in the local innate immune of intestinal mucosa including intestinal epithelial cells is still not clear. The preliminary study of applicant firstly proved that NLRC5 and type I IFN involved in the innate immune response of porcine small intestinal epithelial cells (IPEC-J2) resist porcine sapelovirus(PSV), which suggests NLRC5 has an important role in antiviral immune of intestine mucosa including intestinal epithelial cells and closely association with type I IFN production. Therefore, this study aims to build a NLRC5 knockout model of IPEC-J2 cells, and study the effect of NLRC5 on the type I IFN production in that cell model as the PSV infection. Furthermore, the effect of NLRC5 on the RLRs-IFN pathway and the related molecular mechanism were determined using genome-wide expression microarray. This study provides a basis for further investigations on the function of NLRC5 in the innate immune of intestinal mucosa.

NLRC5（NLR family,CARD domain containing 5），是新近发现的天然免疫受体NLRs家族成员之一，在人和小鼠的多种细胞类型中，已证实其对I型IFN产生通路具有显著的调控作用，在抗病原微生物天然免疫中扮演重要角色。但目前，关于NLRC5在肠上皮细胞及肠黏膜局部天然免疫中的作用还不清楚。申请者在前期研究工作中首次证明，NLRC5与I型IFN共同参与了猪小肠上皮细胞对猪萨佩罗病毒（PSV）的天然免疫应答。提示NLRC5在肠黏膜抗病毒天然免疫中也具有重要作用，并与I型IFN的产生有紧密联系。鉴于此，本项目拟构建NLRC5基因敲低的猪小肠上皮细胞模型，以PSV作为模式病毒，研究NLRC5受体对I型干扰素产生的影响，同时利用全基因组表达谱芯片判定NLRC5对RLRs-IFN信号通路的影响，解析相关分子调控机制，为鉴定NLRC5在肠黏膜局部天然免疫中的相关功能提供基础.

一、项目背景.NLRC5是新近发现的天然免疫受体NLRs家族成员之一，在人和小鼠的多种细胞类型中，已证实其对I型IFN产生通路具有显著的调控作用，在抗病原微生物天然免疫中扮演重要角色。但目前，关于NLRC5在肠黏膜天然免疫中的作用还不清楚。本研究构建了NLRC5基因敲低的猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）模型，以猪萨佩罗病毒（PSV）作为模式病毒，探讨NLRC5受体对I型干扰素产生的影响，同时利用RNA-Seq技术在转录组层面解析NLRC5相关通路的分子调控机制，为鉴定NLRC5在肠黏膜天然免疫中的相关功能提供基础。.二、本研究主要内容.2.1 检测猪NLRC5、 I型干扰素mRNA及PSV病毒基因的荧光定量PCR方法的建立，以及PSV感染情况下IPEC-J2细胞的稳定内参基因的筛选.2.2 NLRC5 基因敲低的IPEC-J2细胞模型的构建.2.3 NLRC5对PSV诱导IPEC-J2细胞I型IFN产生的影响.2.4 NLRC5对PSV感染IPEC-J2细胞中整体相关信号通路的影响.三、重要结果.3.1 NLRC5 对PSV诱导IPEC-J2细胞I型IFN的产生起正向调节作用。.3.2 NLRC5 涉及多条天然免疫受体、细胞因子及免疫效应因子通路，此外在感染炎症通路中也可能发挥重要作用。.四、关键数据及其科学意义.4.1 确定TBP及RPL32内参基因组合在PSV感染IPEC-J2细胞情况下最为稳定。该结果为基因相对表达定量检测提供了可靠的内参基础。.4.2 成功构建了NLRC5 基因表达敲低的IPEC-J2细胞模型（基因表达下调效率达到94%）。该结果为进一步研究提供了可靠的细胞模型。.4.3 在PSV感染后多个不同时间点，NLRC5基因敲低试验组I型IFN的mRNA表达水平均显著低于NLRC5基因正常的对照组，同时试验组I型IFN的蛋白表达量也显著低于对照组。该结果证明NLRC5 在PSV感染IPEC-J2细胞情况下，对I型IFN的产生起正向调节作用。.4.4 利用RNA-Seq对PSV感染后6h、12h及24h三个不同时间点下，NLRC5基因敲低的试验组及转染空载体的对照组的差异表达基因进行筛选，分别获得61、117和22个差异表达基因，进一步分析表明，NLRC5 涉及多条天然免疫及感染炎症相关通路。该结果证明NLRC5在肠黏膜抗病毒天然免疫中扮演重要角色。