GPR50在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的作用及分子机制研究

GPR50(G protein-coupled receptor 50), a lone G protein coupled receptor located on the X chromosome, is a member of the G protein coupled receptor super family. In recent years, it has been proved that GPR50 plays an important role in many physiological activities, but the role of GPR50 in reproduction is unclear. It was the first time for the applicants to prove the existence of GPR50 in yak oocytes. In addition, we found that the expression of GPR50 gene and protein increased significantly during the maturation of yak oocytes compared with bovine oocytes, which indicates that GPR50 may play an important role in the maturation of Yak oocytes. In view of this, the project intends to construct the model of GPR50 over-expression and low-expression yak oocytes, and research on the expression and role of GPR50 in the maturation process of yak oocytes with some techniques, such as confocal microscopy, immunofluorescence, real-time RT-PCR and Western blot and so on. This study provides the foundation for further analysing the molecular mechanism of oocyte maturation and knowing the specificity of reproduction of yak and other highland animals.

GPR50，是位于X染色体上的孤独G蛋白偶联受体，属于G蛋白偶联受体超级家族成员之一。近年来已证实GPR50在多种生理活动中发挥重要作用，但目前关于GPR50在繁殖中的作用还不清楚。申请者在前期研究工作中首次证明牦牛卵母细胞中存在GPR50，并与牛相较后发现，在牦牛卵母细胞发育成熟过程中GPR50的基因及蛋白表达量均显著增高，提示GPR50可能在牦牛卵母细胞成熟中扮演了重要角色。鉴于此，本项目拟构建GPR50过表达及敲低牦牛卵母细胞模型，采用共聚焦显微镜、免疫荧光、荧光定量PCR及Western Blot等技术研究GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中的表达定位及其相关作用,为进一步解析卵母细胞发育成熟的分子机制及了解牦牛等高原动物繁殖的特异性提供基础。

一、项目背景. GPR50，是位于X染色体上的孤独G蛋白偶联受体，属于G蛋白偶联受体超级家族成员之一。近年来已证实GPR50在多种生理活动中发挥重要作用，但目前关于GPR50在繁殖中的作用还不清楚。本项目组在前期研究工作中首次证明牦牛卵母细胞中存在GPR50，并发现在牦牛卵母细胞发育成熟过程中GPR50表达量显著增高，提示GPR50可能在牦牛卵母细胞成熟中扮演了重要角色。本项目构建了GPR50过表达及敲低牦牛卵母细胞模型，采用共聚焦显微镜、免疫荧光、荧光定量PCR及Western Blot等技术研究GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中的表达定位及其相关作用,为进一步解析卵母细胞发育成熟的分子机制及了解牦牛等高原动物繁殖的特异性提供基础。 .二、本研究主要内容 . 2.1精确确定牦牛卵母细胞体外培养到达GV期、GVBD期、MI期及MⅡ期四个成熟关键期的时间点。进一步稳定本项目涉及的相关基因的荧光定量检测方法。. 2.2 采用荧光定量、免疫荧光染色及共聚焦显微镜技术检测GPR50在牦牛卵母细胞体外成熟进程中关键期的亚细胞的表达规律及动态定位情况。. 2.3 构建GPR50过表达及敲低牦牛卵母细胞模型。. 2.4 在GPR50过表达及敲低牦牛卵母细胞模型的基础上，研究GPR50 对牦牛卵母细胞成熟的影响。.三、重要结果 . 本研究发现GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中发挥重要作用，对牦牛卵母的成熟率有显著影响，首次证实GPR50在繁殖生理中也发挥重要作用。.四、关键数据及其科学意义. 4.1首次精确确定了牦牛卵母细胞体外培养到达GV期、GVBD期、MI期及MⅡ期四个成熟关键期的时间点。为接下来对牦牛卵母细胞的相关研究提供了一个准确的收样数据点。. 4.2清楚了GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中的确切亚细胞定位。. 4.3 构建GPR50真核过表达载体及靶向GPR50 mRNA的Morpholinos干扰反义寡核苷酸，建立了GPR50过表达及敲低牦牛卵母细胞模型。该结果为进一步研究提供了可靠的细胞模型。. 4.4在GPR50过表达及敲低牦牛卵母细胞模型的基础上，明确了GPR50对牦牛卵母细胞成熟的影响，证实GPR50在卵母细胞成熟中发挥重要作用。