基于细胞药代动力学的非酒精性脂肪肝中P450s代谢调控机制研究

More and more people faced to the metabolic syndrome, including non alcoholic fatty liver disease(NAFLD), obesity, and type II diabetes, because of the high fat and high fructose diet. During the development of NAFLD, lipid accumulation and inflammation leads to live fibrosis and cirrhosis, as well as the variation of metabolic enzymes. It is an important issue that the metabolism ability is weaken during liver diseases. However, earlier studies were mainly focused on the transcription regulation of P450s, while activity of enzymes should be the goldstandard of enzyme evaluation. This project is to study the P450s regulation in transcription, translation and activity based on cell pharmacokinetics and to evaluate the function of silybin on mitochondria and endoplasmic reticulum during NAFLD. It is to reveal the regulation on both liver protection and metabolic enzymes of hepatoprotective agents, which promotes the clinical use of hepatoprotective medicine and its secondary development.

在当今社会高脂高糖的饮食结构下，非酒精性脂肪肝病、肥胖、II型糖尿病等代谢综合症的发病率越来越高。非酒精性脂肪肝的病理进程中，脂质蓄积和炎症是引发严重肝病如肝纤维化、肝硬化的元凶，同时影响肝脏代谢酶水平，导致肝脏对药物和化学异物的代谢能力减弱，危害机体健康。肝病状态下的代谢酶发生改变是肝病的重要问题，然而早期关于代谢酶调控机制的研究主要集中在转录水平，忽略了活性才是最终评价代谢能力的金标准。本项目以非酒精性脂肪肝为模型，具有明确保肝抗炎作用的水飞蓟宾作为工具药，基于细胞药代动力学的基本理论，从转录、翻译和活性三个水平，全面探究代谢酶的调控机制，揭示肝病状态下肝细胞主要细胞器线粒体和内质网的相互作用在代谢酶调控中的关键作用，阐明保肝药协同发挥肝保护作用和代谢酶调控作用的途径和机制，对保肝药的临床使用和二次开发具有重要意义。

本课题在非酒精性脂肪肝模型上，对保肝药水飞蓟宾的代谢调控作用进行了系统的研究，同步考察了水飞蓟宾对内源性小分子代谢和外源性化学异物代谢的调节作用，全面揭示了水飞蓟宾发挥代谢调节作用的机制，为水飞蓟宾的临床应用提供了药理和药代方面的双重支持。研究结果主要包括三个部分：. 创新性地发现非酒精性脂肪肝状态下肝脏内质网应激参与P450酶活性的直接调控，内质网应激时，内质网和线粒体间的相互作用发生变化，Ca2+从内质网大量释放，导致胞浆内Ca2+水平升高，同时伴随着线粒体内Ca2+水平升高，线粒体呼吸链复合物I (NADH氧化酶)和呼吸链复合物III(细胞色素c氧化还原酶) 活力显著下降，cyt c从线粒体内膜上释放增加，与P450竞争结合细胞色素b5降低酶活，在此基础上揭示了水飞蓟宾通过调控肝脏内质网应激直接调控疾病状态下P450酶活性的作用机制。. 研究了水飞蓟宾对非酒精性脂肪肝小鼠及小鼠原代肝细胞主要I相代谢酶CYP3A的影响和调控机制，发现水飞蓟宾可逆转高脂饮食和条件培养基引起的肝细胞CYP3A表达与活性下调、NAD+水平降低和NAD+依赖的SIRT2水平。水飞蓟宾干预后，SIRT2的脱乙酰化作用得以恢复，降低了NF-κB p65亚基的乙酰化水平，减少了p65的入核，从而减少对PXR的转录抑制。通过过表达SIRT2和补充NAD+，可以使得AC-NF-κB p65水平降低，NF-κB p65入核显著减少，从而减少对PXR的抑制，逆转了下游基因CYP3A的转录与活性下调。. 运用代谢组学的方法，研究了水飞蓟宾对非酒精性脂肪肝小鼠及小鼠原代肝细胞内源性小分子代谢物的影响。受影响较大的代谢为胆固醇的合成、酮体的生成以及氨基酸代谢，如丙氨酸代谢、天冬氨酸代谢、甘氨酸代谢等。给予水飞蓟宾后小鼠肝脏代谢差异主要集中在氨基酸代谢如丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢以及甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢，此外还有氨基酰-tRNA合成以及氮代谢和三羧酸循环。. 通过以上研究，揭示了水飞蓟宾调节脂肪肝状态下的内、外源性物质的代谢机制，为水飞蓟宾作为保肝药使用时，联用药物可能需要剂量调整提供了理论基础。