毛果杨次生壁CesAs敲除对木材形成和CSCs复合体的影响

Wood is used as raw material for many industries in the national economy and the cellulose in secondary cell wall (SCW) makes up more than 40% of the total weight in wood. However, it is very weak in molecular mechanism of cellulose synthesis in wood. On the basis of our data together with progress of literature, it suggests that SCW cellulose synthases (CesAs) in trees are different from those in herbaceous plants. Loss-of-function of the SCW CesAs in wood formation and cellulose synthase complex (CSC) remains to be identified. In this project, using tree genetic and wood anatomical methods, we determine the role of individual and multiple gene knockout of Populus trichocarpa SCW CesAs in wood formation. We isolate the SCW CSCs from Populus developing xylems through biochemical methods, and identify types and components of the SCW CSCs. Using these SCW cesa mutants, we explore the role of individual and multiple CesA gene knockout in SCW CSCs. This research will be scientific in understanding molecular mechanism of wood cellulose formation and heredity improvement on wood properties in the future.

木材是国民经济多个行业的原材料，次生壁纤维素约占木材重量40%以上。然而，木材纤维素形成的分子基础仍很薄弱。基于我们前期研究结果和文献进展显示，树木次生壁纤维素合酶(cellulose synthase,CesA)是不同于草本植物的。次生壁CesAs在木材形成上的loss-of-function功能及其对纤维素合酶复合体(cellulose synthase complex,CSC)的影响，均不明确。本项目用林木遗传学和木材结构解剖手段，阐明毛果杨次生壁CesA单个成员以及多成员联合敲除对木材形成的作用；采用生物化学手段分离毛果杨次生壁CSCs，解析次生壁CSCs类型及其亚基构成；基于各类次生壁cesa突变体，探究单个或多个CesA缺失对次生壁CSC复合体状态和功能的改变。这一研究对理解木材纤维素形成机制和今后木材性状的遗传改良，具有重要的科学意义。

木材是自然界一类纤维素非常丰富的生物质，然而树木生物合成木材纤维素的CesAs酶类及其作用机制尚不明确。项目围绕次毛果杨次生壁CesAs敲除对其木材形成和CSCs复合体的影响这一目标，创制了毛果杨次生壁PtrCesAs突变体、解析了突变体在木材次生壁形成和纤维素合成上的缺陷、探索了次生壁CesAs敲除对CSCs复合体形成的影响。用CRISPR/CAS9基因编辑技术，创制出PtrCesA4、PtrCesA7A、PtrCesA7B、PtrCesA8A、PtrCesA8B、PtrCesA7A/B、PtrCesA8A/B、PtrCesA4/7A/B、PtrCesA1A/1B、PtrCesA3C/3D多个PtrCesAs基因敲除突变体。ptrcesa4、7ab、8ab突变体表现出相同的生长缺陷表型，如匍匐状植株，茎杆脆等，这表明这三类PtrCesAs功能是相同的且不冗余。ptrcesa7a和7b、ptrcesa8a和8b单突变体没有明显的缺陷表型，表明两者之间功能是冗余的。ptrcesa1ab、ptrcesa3cd突变体幼树茎杆无明显匍匐状和脆性缺陷，表明他们不属于次生壁PtrCesAs。电镜观察显示ptrcesa4、7ab、8ab突变体木质纤维和导管明显塌陷，次生壁多层结构缺陷成了一层，且纤维导管细胞壁结构及其内腔发育严重受损，这些结果表明PtrCesA4、7A/B和8A/B对木材细胞壁形成是必须的。木材化学成分测定显示ptrcesa4、7ab、8ab突变体木材纤维素含量约4%，为WT（约41%）的十分之一，表明PtrCesA4、7A/B和8A/B合成了木材次生壁所有的纤维素。ptrcesa4、7ab、8ab突变体不能发育出应拉木G-纤维，表明PtrCesA4、7A/B和8A/B是杨树应拉木纤维G层发育所必须的。此外，PtrCesA4、7A/B和8A/B参与杨树初生和次生韧皮纤维独特壁结构的形成[S1+S2+n(G+L)/G]。特异性抗体免疫印迹表明, 敲除一类次生壁 PtrCesA大幅度降低了另两类的次生壁PtrCesAs含量，这表明PtrCesA4、7A/B和8A/B构建了次生壁CSCs的核心亚基，缺少任何一类则次生壁CSC不能形成，导致杨树完成不能合成木材次生壁纤维素。这些研究结果回答了杨树木材纤维素主要由谁合成的，同时丰富了木材形成的分子基础。