PtrGARP1参与毛果杨幼茎木质化形成的分子机制研究

Wood is the lignified tissues from tree stem secondary growth, and used as raw material for many industries in the national economy. However, it is much weak in molecular mechanism of wood formation, which motivates the researchers to ascertain various molecular pathways in wood formation. Our previous studies showed that PtrGARP1 (Populus trichocarpa glutamic acid-rich protein 1) gradually increased during the lignification of young stems, and its protein abundance reached high. Overexpression of PtrGARP1 resulted in abnormal lignin deposition in vascular tissues of transgenic Arabidopsis roots. These evidences show that PtrGARP1 functions in the lignification of Populus young stems. In this project, using genetic, molecular, biochemical and anatomical methods, we analyze the relationship between PtrGARP1 expression and young stem lignification; we attain genetic phenotype by gene silencing and overexpression of PtrGARP1 in Populus; we determine the characteristic of PtrGARP1 protein and its molecular operating mode in vivo. These results elucidate molecular mechanism of the involvement of PtrGARP1 in lignification of Populus young stems. This research will not only enrich molecular basis on wood formation, might but also provide a valuable gene used for heredity improvement on wood properties.

木材是国民经济多个行业的原材料，它由树木茎次生生长形成的木质化组织。然而，木材形成的理论基础仍很薄弱，促使人们探索木材形成中的诸多分子途径。在前期研究中我们发现毛果杨的一个富含谷氨酸蛋白(glutamic acid-rich protein 1, PtrGARP1)表达随幼茎木质化程度递增且表达丰度超高，它的过量表达导致转基因拟南芥幼根维管组织出现木质素异常沉积，这些证据表明PtrGARP1参与毛果杨幼茎木质化形成。本项目用遗传学、分子生物学、结构解剖及生物化学手段，分析PtrGARP1表达与毛果杨幼茎木质化的关系，阐明PtrGARP1基因沉默和过表达在木质化形成方面的遗传表型，鉴定PtrGARP1蛋白质分子特性及其在体内的分子作用方式，从而揭示PtrGARP1参与毛果杨幼茎木质化形成的作用机制。这一研究将丰富木材形成的分子基础，同时很可能为木材性状遗传改良提供有价值的基因材料。

木材形成的分子基础较为薄弱，识别参与木材形成的遗传因子仍有着重要的科学价值。我们的前期研究暗示，一个未知功能的富含谷氨酸蛋白(PtrGARP1)可能参与毛果杨木材形成。项目围绕“PtrGARP1作用毛果杨幼茎木质化”的目标，开展了“PtrGARP1基因表达与茎木质化关系、基因遗传学功能和可能的蛋白质作用方式”三方面的研究。qRT-PCR数据显示PtrGARP1;1/1;2转录水平在毛果杨木质部组织内最高，且随茎节木质化程度增强而升高。RNA原位杂交数据显示，茎木质纤维、导管和韧皮纤维呈现强烈的棕色信号。基于启动子驱动GUS活性检测显示，PtrGARP1;1启动子活性主要集中于茎木质部纤维，较高的PtrGARP1;2启动子活性存在于成熟茎、叶脉和根。这些结果明确了PtrGARP1基因表达与茎木质化的关系。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，创制了PtrGARP1;1/1;2单、双基因敲除突变体。与野生型相比，PtrGARP1;1单突变体植株轻微变矮，PtrGARP1;1/1;2双突变体植株明显矮小；木材结构解剖显示PtrGARP1;1/1;2双突变体木质部组织径向宽度明显小于野生型；木材成分测定显示突变体纤维素下降、木质素上升。这些结果表明PtrGARP1在木质组织发育上显示出重要的作用，参与了木材形成。通过融合的荧光蛋白GFP跟踪，确定PtrGARP1;1和PtrGARP1;2定位于细胞质。PtrGARP1;1-GFP融合蛋白分子量估测为65kDa，则PtrGARP1:1约为38kDa，超过其预测的分子量（20kDa），表明PtrGARP1:1蛋白质存在翻译后修饰。基于构建的毛果杨发育木质部基因cDNA酵母表达文库，筛选出与PtrGARP1;1互作蓝斑菌落20多个。项目研究结果丰富了木材形成的分子基础，为木材性状改良提供了有价值的基因。