巨噬细胞中IKKβ对TNF-α胞内运输、分泌与吞噬的负向调节机制研究

TNF-α, mainly produced by macrophages and monocytes, plays an important role in cytokine network in vivo. IKKβ is an essential activator of the canonical NF-κB cascade. In our previous study, we found that inhibition of IKKβ in resting macrophages could increase supernatant TNF-α level without affecting TNF-α mRNA and simultaneously enhanced phagocytosis. The present study is a further exploration based on our previous study. First, to rule out certain off-target effects of IKKβ inhibitors, a comparative study on IKKβ(-) and IKKβ(+) cells will be performed. We focus on the constitutive exocytosis pathway of TNF-α in macrophages (Golgi complex → recycling endosomes → phagocytic cup) to look for the potential molecular targets of IKKβ negative regulation of TNF-α trafficking and secretion, and phagocytosis of the resting macrophages. Next, the found targets will be verified by several IKKβ inhibitors (e.g. rhein, etc.). This study not only has important pathological and physiological significances for further revealing the intracellular mechanisms of macrophages, but also provides a pharmacological basis for the clinical application of IKKβ inhibitors.

TNF-α是主要由巨噬细胞和单核细胞产生的，在细胞因子网络中极为重要的调节因子。IKKβ则是介导NF-κB活化经典通路的关键亚基。我们前期研究发现，静息态巨噬细胞中IKKβ被抑制后能在不影响TNF-α mRNA转录的前提下增加细胞上清中TNF-α含量并同时提高细胞的吞噬能力。本课题以此为基础展开研究：为排除IKKβ抑制剂可能导致的脱靶效应，先对IKKβ敲下前后两种细胞进行比较研究，以TNF-α在巨噬细胞内建构型胞吐途径（高尔基体→再循环内体→吞噬杯）为主线，寻找静息态巨噬细胞内IKKβ负向调节TNF-α胞内运输、分泌及吞噬的作用靶点；然后用含大黄酸在内的IKKβ抑制剂对靶点进行验证，以此明晰静息态巨噬细胞内IKKβ负向调节上清中TNF-α以及细胞吞噬功能的内在分子机制。本研究不仅对深入的了解巨噬细胞内部分子机制具有重要的病理生理意义，更能为IKKβ抑制剂在临床的合理使用提供药理学依据。

TNF-α是主要由巨噬细胞和单核细胞产生的，在细胞因子网络中极为重要的调节因子。IKKβ则是介导NF-κB活化经典通路的关键亚基。我们前期研究发现，静息态巨噬细胞中IKKβ被抑制后能在不影响TNF-α mRNA转录的前提下增加细胞上清中TNF-α含量并同时提高细胞的吞噬能力。为了阐明其潜在的调节机制，同时排除IKKβ抑制剂可能导致的脱靶效应，我们首先获得了IKKβ基因缺陷的细胞（命名为IKKβ(-)），然后对IKKβ敲下前后两种细胞进行了比较研究，以TNF-α在巨噬细胞内建构型胞吐途径（高尔基体→再循环内体→吞噬杯）为主线，寻找静息态巨噬细胞内IKKβ负向调节TNF-α胞内运输、分泌及吞噬的作用靶点。我们分别对比了两种细胞在组织蛋白酶B活性，溶酶体酸化，TACE活性和蛋白表达的差异性，结果发现它们均不是IKKβ负向调节TNF-α的原因。通过采用全转录组测序法，我们发现IKKβ敲下前后，细胞内差异基因多达2169个，其中转录水平差异极显著的有36个（高表达且高相关性的基因有3个，较低表达但高相关性的基因有5个，高表达但低相关的基因有6个，以及较低表达低相关的基因22个）。我们针对排名前2名的蛋白进行了确证。结果显示，巨噬细胞中的IKKβ敲下后，胞内LY酶活性有了很大程度的增强，而胞内RIM-BP-1/2蛋白表达却无明显影响。综上，本研究发现，巨噬细胞内IKKβ的缺失，会造成LY酶活性的极大程度增强，从而影响了TACE活性，造成了TNF-α分泌增多；而LY酶活性的增强，本身就能直接导致细胞吞噬功能增强。本研究不仅对深入的了解巨噬细胞内部分子机制具有重要的病理生理意义，更能为IKKβ抑制剂在临床的合理用药提供药理学依据。