大肠杆菌O157:H7 EspF蛋白导致出血性结肠炎的分子致病机制研究

Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 (EHEC) is a pathogen that cause serious hemorrhagic colitis, diarrhoea and hemolytic uremic syndrome. As we described recently, the 54aa sequences of N-terminal of EspF protein, targeting mitochondria, induced cell apoptosis, but its molecular pathogenesis is still unclear. We intend to study: (1)to construct 5-8 mutation strains with different PxxP deletion ofespF PRR locus; (2)to reveal the interaction of EspF, SNX9, SNX18 and Nck by using confocal microscope and co-immunoprecipitation; (3)to clarify the regulation and interaction between EspF and other proteins by using 2-DE and mass spectrometry; (4)to observe pathological changes of postinfected intestinal epithelium by performing the mice experiment. epithelium. All in all, Through the techniques and methods above, the function of EspF PxxP, the interaction of EspF and proteins which contain SH3 domain, the regulation of EspF in cell apoptosis will be clarified. We believe our study will play an important scientific significance in revealing the molecular mechanisum of EHEC O157 hemorrhagic colitis , prediting and preventing the epidemic outbreak of E. coli O157: H7.

EspF蛋白是大肠杆菌O157:H7一个重要多功能效应蛋白，可导致严重的出血性结肠炎。本课题组近期证实，大肠杆菌O157:H7 EspF蛋白N端靶向结合细胞线粒体，诱导细胞凋亡，但EspF导致出血性肠炎致病机制尚不十分清楚。本项目拟：（1）采用同源重组技术将EspF蛋白4个PRR的PxxP基序分不同组合缺失，构建5-8株大肠杆菌O157:H7 espF突变株；（2）采用confocal和免疫共沉淀技术，研究EspF与细胞SNX9/18、Nck蛋白的结合和凋亡作用；（3）采用2-DE和质谱技术，研究EspF对蛋白的调控作用；（4）通过动物感染，比较肠上皮细胞病理变化。本项目将对明确EspF蛋白PxxP基序的功能、探索EspF蛋白与细胞含SH3结构蛋白的相互作用、解决EspF蛋白的细胞凋亡和调控作用等关键科学问题、进一步阐明大肠杆菌 O157:H7导致出血性结肠炎的分子致病机制具有科学意义。

项目背景：大肠杆菌O157:H7引起严重的出血性结肠炎、腹泻。大肠杆菌O157:H7 LEE毒力岛的效应蛋白EspF，通过Ⅲ型分泌系统注入肠上皮细胞，破坏细胞线粒体功能，导致细胞凋亡，但大肠杆菌O157:H7 EspF蛋白诱导细胞凋亡和出血性肠炎的分子致病机制仍不甚清楚。.本项目主要研究内容及重要结果:.（1）采用RED同源重组技术，将Esp F蛋白的N端和C端PxxP基序分别缺失，构建了6株EHEC O157:H7△espF、△espFN、△espFC基因缺失株及其回补株。 .（2）采用双分子荧光互补技术，筛选出293个宿主蛋白与EspF蛋白相互作用。7个宿主蛋白与EspF蛋白相互作用，其中SNX9和ANXA6蛋白呈现强阳性，PIGC、TMEM176A和GIMAP2蛋白呈现中等阳性，CAPN11和PDHB蛋白呈现弱阳性。.（3）ROS、JC-1、ELISA、Annexin V-FITC/PI、流式细胞等实验表明，espF基因缺失可减缓HT-29细胞跨膜电位降低，导致HT-29细胞ROS生成水平和TNF-α表达降低，EspF蛋白N端缺失株的Caspase 3/9显著降低，在细胞凋亡中发挥重要作用。.（4）iTRAQ技术鉴定到了3175个蛋白，筛查出230个差异蛋白。野生株导致细胞Annexin A4表达量显著增加，蛋白丰度比为1.713倍。缺失株导致细胞Annexin A1和Annexin A3表达量显著增加，蛋白丰度比分别为1.717倍和1.64倍。.（5）通过动物感染，发现EspF蛋白N端参与并扰乱宿主细胞之间的紧密连接，不参与细胞A/E损伤过程，espF基因突变减弱了大肠杆菌O157:H7对BalB/c小鼠的致病性。.科学意义：本项目初步明确了EspF蛋白N端与C端PxxP基序的功能，研究EspF蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用，探索EspF蛋白的细胞凋亡分子基础和调控作用，对进一步阐明大肠杆菌O157:H7导致出血性结肠炎的分子致病机制具有科学意义。