猪HEV长爪沙鼠感染模型建立及肝脏损伤中TLR4的作用机理

戊型肝炎是一种常见的重要人兽共患病，由于缺少理想的动物模型和传代细胞系，严重阻碍了对本病的深入研究。本研究拟应用猪戊型肝炎病毒（HEV）感染长爪沙鼠，通过测定血液、粪便中病毒和抗体消长，转氨酶变化，比较病理学观察等研究，建立一种能替代猕猴的感染模型。 循Toll样受体4（TLR4）激活NF-kB信号通路，从MyD88依赖性和非依赖性信号途径入手，检测HEV感染长爪沙鼠外周血单核细胞、肝脏、血清中的IL-1、IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α、TNF-β等促炎细胞因子及TLR4、NF-κB的mRNA及蛋白表达。同时，应用TLR4基因缺失细胞系转染HEV ORF2、ORF3表达载体，测定TLR4信号通路相关细胞因子和激动蛋白表达情况。通过比较TRL4信号通路相关因子mRNA和蛋白质表达水平差异，揭示TLR4 在HEV感染引起的肝脏损伤过程中的作用及戊型肝炎病理学形成分子机制。

本项目2011-2012年对云南猪群HEV感染的流行率进行了调查，阳性率为7.8%（RNA阳性），场群流行率达100%，全部流行株均为基因4型，亚型鉴定表明这些流行株有4b、4c、4d、4e、4h等，还有一些未知基因型。选用优势流行毒株感染长爪沙鼠HEV，测定体内病毒载量及变化，发现肝脏从3DPI可检出HEV，7DPI载量最高；肠、胆汁3DPI检出病毒，持续带毒35天；粪便中5DPI检出病毒，持续排毒35天，7DPI、14DPI时病毒载量最高；血液中7DPI病毒载量最高。结合与人、恒河猴、兔和猪的比较病理学研究，抗体和转氨酶（ALT/AST）检测结果，长爪沙鼠感染HEV后，肝脏的病变大致可分为前基（第1周内），中期（2周至4周），后期（5周以后）。HEV感染长爪沙鼠外周血单核细胞（PBMC）IFN-γ在感染3－14DPI时上调，21DPI后下调至正常水平，IL2、TNF-ɑ无变化。表明HEV感染后PBMC可产生IFN-γ，但不产生TNF-α和IL-2。感染长爪沙鼠肝脏中TLR4及相关因子表达检测结果，IL-13和IL-18表达无变化，与致病过程无明显关联。感染早期TNF-α，IL-4，IL-5，IL-6 和TNF-α上调；iNOS，IL-10，KC和 IL-2下调；中期IFN-γ和IL-4上调，其它因子表达逐渐上调；至后期除iNOS上调，NF-κB下调外，其它因子恢复到正常值。通过构建HEV ORF3真核表达质粒转染肝癌细胞系HepG2，发现前炎症细胞因子IL-2、IFN-γ都有短暂升高，表明TLR4信号通路激活与HEV ORF3有联系。综上，本项目研究建立了长爪沙鼠HEV感染模型，证实TLR4在HEV感染后激活，主要经非MyD88依赖途径发挥作用，ORF3是与TLR4作用的受体之一。