甘露寡糖制备用甘露聚糖酶的分子改造及高效表达

As a kind of important prebiotics, manno-oligosaccharides exhibit various physiological and health functions, such as regulating intestinal flora, decreasing fat absorption, and controlling postprandial blood glucose, and show broad application prospects. However, the wild type β-mannanases with low stability and hydrolysis efficiency are not suitable for producing manno-oligosaccharides. Therefore, there are still many problems in the production of manno-oligosaccharides, such as low efficiency and high cost, which limit their researches and applications. In previous researches, two β-mannanases from glycoside hydrolase families 113 and 134 were obtained, which have great application potential in the production of manno-oligosaccharides. Their molecular structures were further resolved. Therefore, this proposal will modify the above β-mannanases based on their molecular structures and catalytic mechanisms. To improve their applicabilities in the production of manno-oligosaccharides, the enzymes will be expressed in high levels. Then, the technologies for efficient production of manno-oligosaccharides will be developed. The research results of this proposal will not only provide theoretical basis for the molecular modification and high-level expression of β-mannanases, but also contribute to the improvement of application to manno-oligosaccharides production. It is of important significance for both industry and academia.

甘露寡糖作为一类重要的益生元，具有调节肠道菌群、抑制脂肪吸收、控制餐后血糖等多种功能活性，在功能性食品等领域具有广阔的应用前景。由于野生型甘露聚糖酶存在稳定性差、水解效率低等诸多不足，导致甘露寡糖的酶法制备还存在许多难题，如生产效率低、生产成本高等，这严重限制了甘露寡糖的研究与应用。在前期研究过程中，已获得两种来源于糖苷水解酶113和134家族的、具有甘露寡糖酶法制备应用潜力的甘露聚糖酶，并解析了它们的晶体结构。本项目根据甘露寡糖酶法制备过程中的实际需求，在已有甘露聚糖酶的基础上，结合其空间结构和催化机制，研究甘露聚糖酶的分子改造和高效表达，提高它们在甘露寡糖酶法制备中的应用适应性，并建立高效的甘露寡糖酶法制备技术。本项目研究成果将为甘露聚糖酶的分子改造和高效表达提供理论基础，也将为甘露寡糖的酶法高效制备提供实践依据，具有重要的理论意义和应用价值。

甘露寡糖是一类重要的益生元，具有调节肠道菌群、抑制脂肪吸收、控制餐后血糖等多种功能活性，在功能食品等领域具有广阔的应用前景。由于大多数甘露聚糖酶存在稳定性差、水解效率低等诸多不足，导致甘露寡糖的酶法制备还存在许多难题，如生产效率低、生产成本高等，严重限制了甘露寡糖的研究与应用。本项目根据甘露寡糖酶法制备过程中的实际需求，从微生物中发掘了多个新型甘露聚糖酶，研究了甘露聚糖酶的酶学性质和水解特性；通过理性设计和定向进化对甘露聚糖酶进行了分子改造，提高了甘露聚糖酶对不同底物的催化效率；实现了甘露聚糖酶的高效表达，提高了它们在甘露寡糖酶法制备中的应用适应性；开发了多种甘露聚糖高效水解方法，建立了多种甘露寡糖酶法制备技术。本项目从微孢根霉、黑曲霉、产黄青霉、樟绒枝霉等微生物中发掘了4种酶学性质优良的甘露聚糖酶。微孢根霉甘露聚糖酶（mRmMan134A）水解甘露聚糖主要产生聚合度3-5的甘露寡糖。樟绒枝霉甘露聚糖酶（McMan5B）最适温度为75℃，经100℃处理30min后仍能保留50%以上的酶活力。对米黑根毛霉甘露聚糖酶进行了分子改造，获得了一个正向突变体（RmMan5AM2）。该突变体对魔芋粉和瓜尔胶的比酶活力有明显提高，对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的Km值分别提高了18.4%、16.7%和12.8%。经过高密度发酵，该突变体的产酶水平达176000U/mL，是目前甘露聚糖酶的最高产酶水平。基于上述甘露聚糖酶，实现了5种甘露寡糖的酶法高效制备，如决明子甘露寡糖、魔芋甘露寡糖、部分水解香豆胶、部分水解魔芋胶等。这些甘露寡糖的原料水解率在80%-92%之间，产物得率在70%-89%之间，产品质量符合相关国家标准要求。本项目的研究成果为甘露聚糖酶的发掘、改造和表达提供了理论依据，也为甘露寡糖的酶法高效制备提供了实践依据，具有重要的理论意义和应用价值。