大黄素衍生物A调控RAC1/cofilin信号通路抑制卵巢癌淋巴结细胞定向转移的作用及干预靶点确认

Ovarian cancer is one of the most aggressive gynecological oncology due to its high capacity to metastasize. Treatment of metastatic ovarian cancer especial for lymphatic metastasis is challenging for clinicians, as most therapeutic agents have failed to demonstrate improved survival. Thus, new candidates with antimetastatic activity are much needed. Previously, our group showed that the Emodin derivative A have potential as an antimetastatic activity，was synthesised by our preliminary work. To explore the potential antimetastatic mechanisms involved in the ovarian carcinoma cell line with directional highly lymphatic metastasis, by using a series of methods such as western blotting, electron microscope , immunohistochemistry, confocal laser scanning techniques and high resolution mass spectrometry , This project will confirm the interaction mode between RAC1 and emodin derivative A, the molecular mechanism of Emodin derivative A inhibited the ovarian cancer cells with directional lymphatic metastasis invasion and migration, the relationship between Lamellipodia formation ,location and distribution of F-actin and Cofilin expression after RAC1 inhibition or activation in cells.Our ultimate aim is to reveal the key role that Emodin derivative A targeting RAC1/Cofilin pathway inhibited invasion and migration of the ovarian carcinoma cell with directional highly lymphatic metastasis. The research results will provide a good platform for identification the drug target of small molecular, screening the lead compound of antimetastatic drug and a novel molecular therapeutic target in ovarian carcinoma.

卵巢癌是恶性程度高、侵袭能力强的妇科肿瘤之一，治疗卵巢癌转移特别是淋巴结转移仍是临床上面临的最大挑战，急需寻找和发现新的抗转移候选药物。课题组前期合成的大黄素衍生物A具有潜在的抗肿瘤转移的活性。本课题采用不同淋巴结定向转移能力的卵巢癌细胞SKOV3、SKOV3-PM为靶细胞，选择不同浓度的大黄素衍生物A进行体外抗转移实验，通过蛋白印迹、免疫组化、电镜、激光共聚焦扫描及高分辨质谱等技术,确定大黄素衍生物A抗转移作用的作用机制和大黄素衍生物A 与Rac1蛋白相互作用的模式，明确RAC1抑制或激活后，细胞伪足的形成、肌动蛋白结合蛋白Cofilin的定位、分布及与细胞迁移运动的关系，阐明大黄素衍生物A靶向调控RAC1/cofilin通路抑制卵巢癌细胞的侵润转移的关键作用。研究结果为小分子药物靶点确证、筛选抗肿瘤转移药物的先导化合物，卵巢癌淋巴结转移的分子靶向治疗提供良好的研究平台。

本研究旨在探讨大黄素衍生物A对卵巢癌淋巴结不同转移能力SKOV3和SKOV3-PM4细胞运动和侵袭能力的影响，揭示大黄素衍生物A靶向调控RAC1/LIMK1/ cofilin信号通路与抑制卵巢癌细胞运动侵袭作用的机制,明确RAC1的靶点作用。应用划痕实验观察大黄素衍生物A对卵巢癌细胞运动的影响，Matrigel-Transwell方法检测细胞侵袭能力，激光共聚焦技术和扫描电镜观察大黄素衍生物A对卵巢细胞形态和细胞骨架超微结构的影响，RT-PCR和Western blot分别检测RAC1/LIMK1/cofilin通路上LIMK1、PAK1、cofilin的基因和蛋白的表达。实验结果表明，与空白对照组相比，大黄素衍生物A能抑制SKOV3-PM4细胞侵袭和迁移能力，浓度为2.5mg/L，5mg/L和7.5mg/L 的化合物处理24h后，细胞体外迁移和侵袭能力均显著下降 （P<0.01）；细胞出现伪足减少、细胞内微丝断裂，分布紊乱，质膜凹凸不平、细胞间的间隙变宽等超微结构改变；Rac1 Pull-down Assay与Western Blot实验显示：大黄素衍生物A可下调Rac1总蛋白与Rac1-GTPase活性蛋白表达，且存在浓度依赖性；RT-PCR和Western blot结果表明大黄素衍生物A能显著下调LIMK1/cofilin信号通路中LIMK1、cofilin、PAK1基因相对表达和蛋白磷酸化水平(P<0.05)。实验结果提示，大黄素衍生物A具有抑制卵巢癌淋巴结转移细胞运动和侵袭的能力，其作用机制有可能是通过调控RAC1/LIMK1/ cofilin信号通路而实现。同时利用慢病毒转染和基因重组技术构建含荧光素酶报告基因pLVX-RAC1-Luc2-eGFP-Puro质粒,并转染至SKOV3细胞.检测大黄素衍生物调控RAC1蛋白结合的能力。 以RAC1为靶点，建立靶向RAC1抑制肿瘤细胞侵袭转移的大黄素衍生物的筛选平台,研究合成的大黄素衍生物A与RAC1结合的构效关系，为抗卵巢癌转移药物的开发、药物靶点的创新研究奠定坚实的基础。