拟南芥四分体胼胝质降解的机制

In plant, the tetrad is an important structure during male gametophytic development. After meiosis of microspore mother cells is completed, the structure of four male gametophytes surrounded by callose (β-1,3-glucan) is called tetrad. The microspore will released from tetrad after callose degradation, when male gametophyte form exine in tetrad. The tapetum is responsible for degradation of tetrad callose, however the detailed mechanism of tetrads callose degradation remains unknown. The AMS, MYB80 and TEK is important transcription factor in tapetum. The applicant has shown that the callose cannot fully degraded in ams and myb80/tek mutants. Further analysis indicated that there are five members of β-1,3- glucanase family (A6 family) play role in tetrad callose degradation. The degradation of tetrad callose is delayed in a6.1/2/3/4/5 quintet mutant. In this project, the applicant will study the molecular mechanism of degradation of tetrad callose. The research content mainly includes: 1) Analysis of the effect of A6 on the degradation of tetrad callose via fusion protein and enzyme activity assay; 2) Using CRISPR/Cas9 to knockout other genes in a6.1/2/3/4/5 quintet mutant background to analyze which genes are also involved in degradation of tetrad callose; 3) The direct regulation of A6 family genes by upstream transcription factors via in vitro and in vivo experiments. The completion of this project will reveal the significance of tetrad callose degradation in male gametophytic development.

四分体是植物雄配子发育过程中的重要结构。小孢子母细胞在减数分裂完成后，由胼胝质(β-1,3-葡聚糖)所包裹的四个雄配子的结构称为四分体。雄配子在四分体中形成花粉外壁后，胼胝质降解以释放小孢子。胼胝质降解由绒毡层负责，但其具体机制仍不清晰。AMS、MYB80和TEK是绒毡层中重要转录因子。申请人发现，ams及myb80/tek突变体中，胼胝质无法降解。进一步分析表明，β-1,3-葡聚糖酶家族（A6家族）中五个基因参与到了此过程。在a6.1/2/3/4/5五突变体中，胼胝质降解延迟。本项目中，申请人将研究四分体胼胝质降解的分子机制。研究内容主要包括：1）利用融合蛋白和酶活测定，分析A6对胼胝质降解的作用；2）CRISPR/Cas9在五突变体中敲除其他基因，分析哪些基因也参与降解；3）体内外生化实验，分析上游转录因子对A6家族基因的直接调控。本项目的完成将揭示胼胝质降解在雄配子发育过程中的意义。

胼胝质是一种主要由葡聚糖组成的细胞壁结构，它给予细胞一定的物理保护及生物屏障作用。胼胝质的合成和分解直接影响了植物的正常生长代谢、生殖及免疫。在许多高等及低等植物中，胼胝质层的形成是雄配子完成减数分裂和花粉外壁形成的前提条件，然而胼胝质降解的机制及其生物学意义的研究仍旧不足。本项目中，我们结合转录组、遗传学、生物化学等技术手段挖掘了参与四分体胼胝质降解的关键功能基因与调控通路。首先，明确了AMS，MYB80和TEK这三个绒毡层关键转录因子不仅调控花粉外壁的形成，也调控了胼胝质降解过程。通过对多突变体的分析，我们确定了绒毡层中有五个主要的胼胝质酶参与了四分体胼胝质降解过程。在a6多突变体中，胼胝质的降解显著延缓并且影响了花粉外壁的精确模式的建立。进一步的分析表明，胼胝质延迟降解虽然可以恢复花粉外壁缺陷突变体的育性，但是却会降低花粉对外界紫外线的影响。这说明了，四分体胼胝质的精确降解是植物传粉过程中抵抗环境逆境的重要保证。之后，通过原生质体激活、EMSA、ChIP实验验证了AMS，MYB80，TEK分别对这五个A6基因在体外具有激活作用，并且体内也能结合这些基因的相关启动子元件。因此，这三个上游转录因子具有直接调控这五个胼胝质酶基因的转录能力。这表明，花粉外壁的形成与胼胝质降解是处于同一条遗传调控通路，也解释了花粉外壁与胼胝质降解是同步发生的分子机制。我们的研究，为后续通过遗传学方法改造及调控花粉外壁模式以促进植物提升在不同逆境环境下的传粉能力提供了理论基础。