泥蚶血红蛋白抗菌免疫功能及基因多态性研究

泥蚶（Tegillarca granosa）是浙江省滩涂养殖的主导种类，也是我国传统养殖贝类之一。但近年来养殖泥蚶病害死亡频发，因此，探索泥蚶的免疫发生机制和调控机理，研究培育泥蚶抗病新品种显得十分重要。以泥蚶为代表的蚶科经济贝类具有在无脊椎动物中稀有的血红蛋白，在脊椎动物中研究表明血红蛋白具有抗菌、抗病毒和酚氧化酶等免疫功能。本研究以泥蚶血液cDNA文库为平台，利用蛋白分离纯化、分子克隆、荧光定量PCR和SNP等现代生物技术，筛选克隆泥蚶血红蛋白基因；解析其分子结构，查清其在血蛋白中的分子演化地位；研究血红蛋白及其基因对致病细菌的抑菌活性及应答反应，探索贝类血红蛋白的抗菌免疫功能；进一步开发与泥蚶抗菌力关联的SNP标记。本研究对揭示贝类血红蛋白的免疫功能以及血蛋白的演化具有重要的科学价值；另外，SNP分子标记的开发将为泥蚶分子设计育种提供理论指导。

蚶属贝类具有血红蛋白，不同于其它贝类一般是血蓝蛋白，在进化上具有特异性。其它动物的血红蛋白研究表明具有免疫、代谢调控等多重生物学功能，是目前最具研究价值的蛋白之一。本项目以经济蚶科贝类泥蚶为研究对象，第一，利用光镜和扫描电镜两种方法对包括泥蚶等5种动物的血红细胞的表面结构和形态特征进行观察，发现血红蛋白的载体血细胞的大小、表观和形态存在差异，基于血红细胞形态差异，我们推测血红细胞的主要成分血红蛋白结构在贝类和脊椎动物间可能也存在较大差异。第二，通过构建血液cDNA文库，克隆得到了泥蚶3种血红蛋白亚基基因（Tg-HbI、Tg-HbIIA和Tg-HbIIB），并对其进行分子解析及其相关的演化分析，发现泥蚶血红蛋白基因结构的特异性和多样性，采用Genome walking的方法得到了泥蚶三种血红蛋白基因的基因组全长并对其进行了相关分析。研究结果为下一步搜寻泥蚶血红蛋白基因中抗菌相关SNP做了准备。第三，通过构建原核表达载体，对泥蚶血红蛋白基因进行了体外重组表达，抑菌实验结果表明重组蛋白对大肠杆菌、坚强芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌活性。第四，采用qRT-PCR方法分析三种血红蛋白基因在不同组织中的表达情况，同时对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticu）、脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）感染后泥蚶血细胞中三种血红蛋白基因mRNA表达变化进行了检测。研究发现泥蚶Tg-HbI和 Tg-HBIIA对革兰氏阳性细菌引起的免疫刺激比较敏感；Tg-HBIIB对于革兰氏阴性细菌的刺激更为敏感。最后，我们对泥蚶三种Hb基因外显子区域进行了SNP检测，并对Tg-Hb部分SNP位点多态性和副溶血弧菌敏感性进行了相关分析。分析发现Tg-Hbs的第二个外显子区域的有义突变HbIIA-E2-146和 HbIIB-E2-23在敏感和抗菌群体中存在显著差异，这些SNP位点可以用于下一步抗病家系的选育。.总之，通过mRNA水平的免疫应答表达实验、SNP关联分析和体外表达蛋白抑菌实验初步发现了泥蚶血红蛋白的抗菌免疫功能，为深入研究泥蚶血红蛋白抗菌免疫机制和血红蛋白相关开发利用奠定了基础。通过本项目的研究，共发表学术论文8篇，其中SCI收录论文6篇，申请发明专利1项，培养研究生3名。相关成果还获得宁波市优秀自然科学一等奖和浙江省自然科学学术奖三等奖。