基于过氧化物酶活性和衍生多肽的泥蚶血红蛋白抗菌机制研究

Funded by a NSFC project (No. 31001097), we studied the hemoglobin (Tg-Hb) of Tegillarca granosa at molecular and protein levels in previous research. Antibacterial activity of Tg-Hb was determined by observations of its response to bacterial challenge, the association between its gene SNPs and protein antibacterial activity, and the antibacterial activity tested using recombinantly expressed protein. However, the mechanism of antibacterial activity is not clear yet. In the present project, we propose to study Tg-Hb’s antibacterial mechanism from two aspects: Tg-Hb peroxidase activity and Tg-Hb derived antibacterial peptides. Major objectives of the project include: (1) research on antibacterial activity of Tg-Hb based on PO activity, (2) comparative analysis of antibacterial activity between purified natural peptides and peptides prepared by enzymatic digestion in vitro, (3) insight into mechanism for antibacterial peptide production from Tg-Hb in vivo, and (4) antibacterial mechanism of Tg-Hb derived peptides. The proposed project aims at uncovering the antibacterial mechanism of Tg-Hb and its derived peptides, and identification of antibacterial peptides.

在前期国家自然科学青年基金项目的资助下(项目号：31001097)，对泥蚶血红蛋白这一贝类中特异的呼吸蛋白从分子和蛋白层面进行了系统的研究，通过mRNA水平的抗菌免疫应答表达实验、基因SNP与抗菌性状关联分析天然和表达蛋白抑菌实验等初步发现了泥蚶血红蛋白具有抗菌免疫活性，但对其产生抗菌活性的机制不甚清楚。本项目拟从血红蛋白本身过氧化物酶活性及其衍生抗菌肽的产生方式两方面来研究其抗菌免疫机制。主要研究内容包括：（1）基于过氧化物酶活性的泥蚶抗菌机理研究；（2）泥蚶血红蛋白源体外酶解和体内天然抗菌肽纯化、抗菌活性比较分析；（3）泥蚶血红蛋白源体内天然抗菌肽产生分子机制研究；（4）血红蛋白源抗菌肽抗菌机制研究。本项目旨在揭示泥蚶血红蛋白抗菌机理及其衍生抗菌肽抗菌机制，并筛选出具有较好抗菌活性的蛋白和抗菌肽。

蚶科贝类是为数不多具有红色血液的软体动物类群，是研究无脊椎动物血红性状功能和进化良好的动物模型，通过前期研究，我们已经从分子和蛋白层面发现了泥蚶血红蛋白具有较强的抗菌活性，是泥蚶抵御细菌入侵不可或缺的一道屏障，但其分子机制还不太清楚。本项目从泥蚶血红蛋白的过氧化物酶活性和酶解的衍生多肽两方面入手发现并证实了血红蛋白的抗菌机理。主要研究发现（1）泥蚶血红蛋白Tg-Hb通过过氧化物酶活性产生O •- 2，自身降解产生的游离铁进一步催化H2O2和O •- 2反应生成强氧化性的•OH发挥抗菌作用，并研究证实了Tg-Hb的血红素口袋是Tg-Hb利用过氧化物酶活性发挥抗菌作用的关键结构；（2）针对Tg-Hb对不同的菌抑制效果不同，研究发现在不用菌中Tg-Hb产•OH差异导致其抑菌效果的差别，同时发现非敏感菌的血红素摄取系统可能在其逃避Tg-Hb作用中发挥重要作用；（3）通过酶解Tg-Hb并纯化后，发现多种多肽具有杀菌活性，在泥蚶细菌攻毒后血浆中也发现了大量血红蛋白源多肽。总之，Tg-Hb在体内的抗菌机理如下：Tg-Hb存在于绝大部分泥蚶血细胞中，在泥蚶血细胞受外源物刺激时，Tg-Hb以过氧化物酶活性参与呼吸爆发，产生活性氧发挥抗菌作用。同时，Tg-Hb在此氧化环境中变性分解，酶解成抗菌肽，进一步发挥抗菌活性。.另外，我们还通过系统进化和基因组线性分析，发现蚶科贝类Hb和脊椎动物Hb共同起源于单一祖先基因，突破了国际学界关于无脊椎动物血红性状为“独立起源演化”的传统认知。研究结果不仅揭示了软体动物Hb基因簇的起源演化历程，也为理解动物血红性状的宏观起源演化提供了新认知。.课题组还与上市公司宁波美康生物科技有限公司合作，把研发的泥蚶血红蛋白源抗菌肽应用到诊断试剂盒中作为防腐剂，初步实现产业化。另外，我们与上海塔望智能科技有限公司合作研制了血液和呼吸蛋白氧结合力测试系统并申报了专利。