腹腔感染时TRPC6通道对NETs损害血管内皮细胞通透性和增加炎症浸润的调控机制

Neutrophil extracellular traps (NETs) were found in the activated neutrophils (PMN) during abdominal sepsis. The previous study has shown that NETs could increase the permeability of vascular endothelium cell (EC) and cause the inflammatory infiltration during sepsis. However, the detailed molecular mechanisms were unclear. Our preliminary experiment in vitro showed that the changes of intracellular calcium mediated by the calcium channel TRPC6 were involved when NETs injured EC, but the detailed molecules or signal pathway were undiscovered. Based on the previous study, we proposed the following hypothesis: histones, as the main content of NETs, directly activated TRPC6, increased the calcium influx into the endothelium, activated the MYLK-NF-kB signal pathway and increased the permeability and inflammatory infiltration of EC. To confirm the above hypothesis, we built up the TRPC6 gene knock-out cecum ligation puncture (CLP) mouse model and performed cell experiments with the molecular techniques of siRNA, immunofluorescence method, patch-clamp, ELISA. This study aims to elucidate the molecule mechanism how the calcium influx mediated by calcium channel TRPC6 mediates the process of EC injury caused by NETs, and may provide the new therapy target and theoretical basis how intestinal dysfunction developed during the abdominal sepsis.

腹腔感染时，中性粒细胞（PMN）活化后产生的胞外陷阱网（NETs）可造成微循环血管内皮细胞（EC）通透性增加和炎症浸润，但具体机制不详。我们前期的细胞学预实验中发现，NETs增加EC通透性的机制可能与钙离子通道TRPC6调控的细胞内外钙离子的变化有关，但NETs中何种主要成分、通过何种信号通路调控整个过程尚不清楚。因此，我们提出以下假说：NETs的主要成分组蛋白直接激活钙离子通道TRPC6，调控钙离子内流入EC，激活MYLK和NF-κB信号通路，从而增加EC的通透性和炎症浸润。为验证这一假说，我们将通过TRPC6基因敲除CLP模型和体外细胞学实验，利用siRNA基因沉默、免疫荧光、膜片钳技术、ELISA等技术，阐明TRPC6介导的钙离子内流在NETs损伤EC的分子机制，从而为腹腔感染时肠道微循环障碍的发生机制提供新的理论基础，可能为腹腔感染、脓毒症提供新的治疗靶点。

中性粒细胞是脓毒症、腹腔感染早期主要的固有免疫效应细胞，活化的中性粒细胞能释放出NETs，捕获感染部位或血液循环中的微生物，利用其上的抗菌物质抑制或杀灭细菌。但是过度释放也能造成细胞组织的损伤，影响器官功能。PMN活化产生的NETs通过何种通路影响血管内皮细胞和参与炎症调控，与肠道微循环障碍发生的机制如何，尚有待研究。.第一部分研究NETs在外科ICU脓毒症发生风险的早期诊断价值，通过纳入42名ICU危重症患者的临床资料发现存活组与病死组在cf-DNA、APACHEII评分、SOFA评分以及脓毒症发生率存在统计学显著性差异。血清cf-DNA浓度预测ICU病死率的最佳阈值为 1.3292 ug/ml，敏感性为75%，特异性为88.2%。高cf-DNA组比低cf-DNA组具有更高的脓毒症发生风险(80.0% vs 37.5%, P=0.019)。研究结论：cf-DNA是预测ICU患者预后的有效预测指标，较高水平cf-DNA 提示更高的脓毒症的风险。 .我们进一步应用DNA酶、不同亚型的组蛋白抗体，在正常小鼠、TRPC6基因敲除鼠探究NETs的形成对肠道微循环功能和血管内皮细胞的影响。研究结论：腹腔感染肠道组织中大量中性粒细胞侵润、活化并释放NETs。NETs的降解破坏降低急性全身炎症性反应和细胞凋亡；清除NETs对于脓毒症时肠道微循环和内皮细胞可能起到保护作用；脓毒症时NETs中H3参与损伤血管内皮细胞的通透性和肠屏障功能的过程。.第三部分我们研究设计是否能通过谷氨酰胺影响NADPH的表达来调控NETs的合成，从而精准发挥其有利作用，降低其对血管内皮细胞的损伤作用。 通过研究我们发现: 脓毒症小鼠模型中，谷氨酰胺的给予引起了较低水平的 cf-DNA/NETs，促进早期恢复至基础水平。但谷氨酰胺的给予并没有使得小鼠外周血中的中性粒细胞内 ROS 水平产生变化。在体外细胞实验中，进一步揭示谷氨酰胺对于中性粒细胞发生 NETosis 并不是必需的，低浓度(0.5 mM)的谷氨酰胺能促进这一过程，但是较高浓度的谷氨酰胺又逐渐使得其受到抑制。结论：谷氨酰胺能通过NADPH调节中性粒细胞的NETosis过程。为临床上调节 NETs 过度释放造成的损伤提供一种治疗选择，但具体机制有待研究。