解析RELM-α调控中性粒细胞迁移机制对重症急性胰腺炎继发急性肺损伤的影响研究

Based on the key effect of pro-inflammatory mediators on severe acute pancreatitis (SAP)and the special effect of anti-inflammation and the promoting tissue repairing of Resistin-like molecule （RELM）-α on inflammation. Our previous study firstly found that the lower expression of RELM-α was positive relatedship of the develpoment of disease in the early stage in AP.As well, the precise mechanisms determining the effect of RELM-α on SAP aassociated with neutrophils （PMN） migration are largely unknown. Therefore, this study established the transgenic zebrafish of the enhanced green fluorescent protein (EGFP) marked gene MPO promoter upstream of PMN using the feature of zebrafish including optical clarity which allows the direct visualization of blood cell behavior, thus investigated the up-regulating expression and silencing expression of RELM-α gene on the migration and the activity of PMN and its effect on the NF-κB and ras-ERK/JNK/P38MAPK-FNK-ICAM-1-MMPs cell signaling pathway in the transgenic zebrafish. Meanwhile, the replication-defective adenovirus serotype 5/F35 (Ad5/F35)- RELM-α and Ad5/F35- RELM-α-SiRNA were constructed, the the effects of up-regulating or sliencing of RELM-α on SAP rats associated with acute lung injury were investigated by animal models in biology, chemical genomics, cellular biology, molecule biology, proteomics and imageology methods. The results of this study might be helpful to explore the newly target of anti-inflammation, thus providing a newly therapeutic strategy for SAP associated with acute lung injury.

基于促炎症介质释放在重症急性胰腺炎（SAP）发生发展中的核心作用及RELM-α在抗炎症及促炎症修复方面的独特作用，我们前期的研究率先发现RELM-α在疾病早期的低表达并与疾病病情呈负相关性，但在疾病中抑制中性粒细胞迁移机制尚未阐明。本项目利用斑马鱼胚胎通体透明，建立中性粒细胞髓过氧化物酶基因启动子EGFP标记转基因动物，无创性直观性观察RELM-α基因缺失或过表达干预后标记后的中性粒细胞在炎症区域的聚集、活性变化等行为特性及所涉及的NF-κB 及Ras-ERK/JNK/P38MAPK-FNK-ICAM-1-MMPs信号传导途径的调控机制，进一步揭示RELM-α 基因调控对SAP继发急性肺损伤大鼠的效应。具体研究涉及动物模式生物学、化学基因组学、细胞生物学、分子生物学、蛋白组学、影像学等，本项目预期的结果将从靶向炎症调控方面揭示SAP继发急性肺损伤治疗思路。

背景: 急性胰腺炎是一种急性炎症性疾病，随着人类生活方式的改变，该病的发病率有逐年增加的趋势。重症急性胰腺炎能够触发白细胞瀑布反应，导致全身炎症反应综合征的发生；引起多脏器损害导致多器官功能障碍综合征危及生命。而SAP早期最多见、最严重的并发症则是急性胰腺炎继发肺损伤。抵抗素样分子α (RELMα) 在肺部有特异性的分布，在哮喘、寄生虫感染、慢性缺氧等各种肺部炎症反应中具有多种不同的调控功能，但RELMα与SAP和APALI的相关性以及在其中的作用机制尚未得到完全阐明。 .方法: 以大鼠为模型分别诱导急性水肿型胰腺炎和SAP，检测血清淀粉酶、C反应蛋白和RELMα 蛋白在肺组织中的表达情况，以了解 RELMα的表达高低 与APALI的相关性。为了研究RELMα对APALI的影响，在诱导SAP前大鼠，静脉注射转染RELMα过表达病毒载体，并在诱导16小时后收集肺和胰腺组织。在检测肺部RELMα 蛋白水平之后，进行胰腺肺组织损伤的组织评分，并检测血清和组织样本中炎症介质水平。为了从另一方面进一步验证以上实验得到的结果，再静脉注射转染靶向敲低RELMα表达的病毒载体，并诱导SAP大鼠模型重复以上实验检测，并且通过TUNEL 和免疫荧光用于评估RELMα敲低大鼠重症急性胰腺炎继发肺损伤模型中肺脏细胞凋亡和上皮屏障完整性。.结果: RELMα 在SAP组肺组织中的表达明显升高，而AEP组则升高不明显，并且RELMα升高的程度与肺损伤严重指数存在明显的相关性。过表达RELMα后诱导的SAP大鼠模型中，血清炎症因子释放增加；包括磷酸化AKT、P65、P38MAPK、ERK以及细胞间粘附分子1（ICAM-1）在内的炎症介质升高；并且加重肺部损伤评分。敲低RELMα表达后诱导的SAP模型中，以上的结果被逆转。另外，RELMα 敲低还能够改善增殖细胞核抗原（PCNA）、B淋巴细胞瘤2基因（Bcl-2）、凋亡、ZO-1 和Claudin-1在SAP 大鼠肺组织中的表达。 .结论: RELMα 与SAP继发肺损伤密切相关，RELMα的表达随着肺部损伤评分的升高而加剧。在APALI的病理过程中，RELMα的表达升高能够上调炎症因子的释放从而加重炎症反应。因此，靶向性的抑制RELMα的表达以及阻断RELMα相关的下游信号分子将对APALI起到治疗作用,为APALI的早期治疗研究提供方向。