马尔尼菲青霉菌抵抗巨噬细胞氧化杀伤致侵袭感染的机制研究

马尔尼菲青霉菌(PM)感染为艾滋病患者中常见的机会性感染，PM如何逃避巨噬细胞的氧化杀伤引起宿主侵袭性感染的机制并未清楚。我们前期的研究发现PM在体外能抵抗过氧化氢的氧化杀伤且色素与PM对氧化杀伤的抵抗有关联。为进一步阐明PM抵抗氧化杀伤的机制，本研究拟通过分离纯化出PM黑素，分析其化学结构，检测黑素对巨噬细胞吞噬效应的影响，分析鉴定PM孢子抵抗氧化杀伤相关蛋白质组，并且通过绿色荧光蛋白标记PM孢子，在体外观测PM孢子被巨噬细胞吞噬的过程和PM孢子能否在巨噬细胞内存活。通过动物实验动态观察PM经呼吸道侵入免疫功能受损小鼠肺部致系统性感染的发展过程，并且模拟PM孢子经呼吸道潜伏感染正常小鼠的过程。同时提取PM菌株酵母相孢子的胞浆抗原，对有PM暴露史的未发病人群血清中是否存在PM的抗体进行检测。明确PM引起侵袭感染的过程和机制，阐明PM感染人类的确切方式和途径。

马尔尼菲青霉(PM)是一种温度双相性真菌，该真菌在东南亚地区流行并且可以引起人类全身性感染。马尔尼菲青霉已成为东南亚地区HIV相关最常见的机会性感染病原体之一。PM能逃避巨噬细胞氧化杀伤的能力在PM引起宿主侵袭性感染中发挥重要作用。本项目从PM色素成分及其作用、PM孢子与巨噬细胞的相互作用、PM次级代谢产物对巨噬细胞的作用等方面探索了PM逃避巨噬细胞氧化杀伤的相关机制。PM在有L-DOPA作为底物培养下，酵母相PM产生棕黑色色素，最适合PM黑化培养的L-DOPA底物浓度是1mM~3Mm。从酵母相PM可以分离提取出黑色颗粒物质；透射电子显微镜显示在PM酵母相细胞内层的细胞壁有球形电子致密颗粒，平均直径100nm左右，呈现串珠状排列。电子顺磁共振、紫外光谱和红外光谱分析证实PM合成的黑色颗粒物质是多巴黑素，PM合成的多巴黑素颗粒可以刺激宿主产生抗体，免疫荧光技术验证PM黑素抗体能与酵母相PM细胞壁相结合。在体外，黑化培养酵母相PM，其对抗真菌药物伊曲康唑、两性霉素B和氟康唑的敏感性下降；黑化的PM酵母相细胞抵抗巨噬细胞吞噬的能力增强，并且能抵抗巨噬细胞内酶溶解消化而存活；黑化的PM在与巨噬细胞接触的早期（24h~48h）表现为巨噬细胞反应性释放H2O2及NO增多，但巨噬细胞自身数量逐渐减少而且巨噬细胞出现崩解现象，黑素化的酵母细胞对巨噬细胞的毒力增强。分析其机制发现PM的次级代谢产物可以激活巨噬细胞表达CD206和分泌细胞因子TNF-α、IL1-β、1L-10，PM次级代谢产物作用于巨噬细胞的早期（24h~48h）可以趋化巨噬细胞增加对PM的吞噬，同时PM次级代谢产物对巨噬细胞产生毒性，导致巨噬细胞凋亡、坏死逐渐增多。酵母相PM的黑素生成能被曲酸有效地抑制，曲酸能增强巨噬细胞吞噬PM孢子的作用，曲酸增强巨噬细胞产生ROS而非NO；此外，曲酸联合两性霉素B对抗PM表现为增敏剂作用。本项目系统地分析PM黑素的理化性质及其在酵母相细胞内的空间分布特点，PM孢子与巨噬细胞的相互作用及PM次级代谢产物的免疫抑制效应，这些成果进一步阐明PM在宿主体内逃避巨噬细胞氧化杀伤致侵袭感染和抗真菌药物治疗抵抗的机制，为发掘新的抗真菌治疗途径奠定了基础。