嗜热真菌酯酶的发掘、基因克隆表达及催化合成食品风味酯作用机制

Esterases （EC 3.1.1.1） is an important class of lipolytic enzyme, capable of hydrolyzing ester bonds of short-chain fatty acids. Some esterases also display strong synthesis activity for ester-containing compounds. Therefore, esterases show great potential applications in industries, such as in food, biochemical engineering, pharmaceutical and agricultue industries. As excellent enzyme producers, thermophilic fungi have drawn a great deal of attentions due to their ability of secreting thermostable enzymes that can be used at relatively high temperature. So far, most of the reported esterases have focused on the bacterial esterases. However relatively few papers have reported on the enzyme production, chanacterization, gene cloning and expression, molecular modification and synthesis mechanism of esterases from thermophilic fungi. Based on the previous research work of esterases in our lab, the proposal will continue to isolate esterase producing thermophilic fungi, clone and efficiently express esterase genes from thermophilic fungi, purify and characterize various esterases, investigate the synthesis mechanism of the esterases and apply the esterases to produce flavor esters. Thus, the project will help to understand the properties and catalysis mechanisms of esterases from thermophilic fungi, as well as produce flavor ester compounds or in some food industries.

酯酶（EC 3.1.1.1）是一类重要的脂肪水解酶，能够催化水解短链脂肪酸。部分酯酶同时也具有很强的催化合成特性，能够合成酯类化合物。酯酶在食品、化工、医药以及农业等领域中显示了重要的应用潜力。嗜热真菌由于所分泌的胞外酶一般都具有优良的温度稳定性，因此受到了研究者的广泛关注。迄今，微生物酯酶的研究报道主要集中于细菌，真菌尤其是嗜热真菌来源酯酶的研究很少，嗜热真菌酯酶的生产、纯化与性质、基因克隆表达、分子改造以及合成作用机理等方面研究薄弱。基于前期酯酶相关的研究基础，本项目拟继续采用高通量筛选法从自然界发掘高产酯酶的嗜热真菌，克隆和高效表达酯酶基因，纯化嗜热真菌酯酶并研究其酶学性质，阐述酯酶合成酯类化合物的催化作用机理，进一步研究嗜热真菌酯酶在风味酯合成等食品工业中的应用。项目的实施不仅有助于了解嗜热真菌酯酶的特性和催化合成机制，而且也可以为酯酶在风味酯合成等食品工业中的应用提供理论依据。

酯酶具有底物特异性、位置特异性和立体选择性，而且可以催化水解、酯化、转酯化等多种反应。基于以上特性，酯酶在食品、医药、化工等众多领域具有广阔的应用前景。然而目前国内酯酶产品较少，市场被诺维信等少数国外公司所垄断。因此，本项目旨在发掘新型、性质优良、适合工业化生产和应用的真菌酯酶。首先，筛选得到一株产酯酶的嗜热真菌太瑞斯梭孢壳并从中分离纯化得到一个酸性角质酶TtCutB，其最适作用条件为pH 4.0和55℃；该酶能够高效催化合成丁酸丁酯，酯化率最高达95%。其次，从嗜热真菌米黑根毛霉中克隆表达得到的一个新型酯酶RmEstB能高效水解叔醇酯；反应4 h时，RmEstB可将98%的乙酸芳樟酯水解成芳樟醇。此外，解析了RmEstB和另一个米黑根毛霉酯酶RmEstA的晶体结构，两酶的结构比较表明引起底物特异性差异的主要原因是底物结合口袋的不同。第三，克隆了一个嗜热真菌樟绒枝霉角质酶基因McCut，并在毕赤酵母中实现高效表达，酶活力达12536 U/mL，蛋白浓度10.8 mg/mL，是目前报道的产角质酶的最高水平；McCut的最适作用pH和温度分别为pH 8.0和45℃，在pH 3.0-10.5和75℃以下有良好的稳定性；该酶具有广泛的底物特异性，不仅能够水解对硝基苯酯和甘油三酯，且可降解角质、聚己内酯和聚丁二酸丁二醇酯；McCut能高效合成丁酸丁酯，在50℃条件下反应4 h，酯化率达96.9%。第四，从内生根毛霉中克隆表达得到两个低温脂肪酶ReLipA和ReLipB，经在5 L发酵罐中高密度发酵，酶活力分别可达1961 U/mL和1395 U/mL；ReLipA能够催化合成油酸甲酯、油酸乙酯和油酸丁酯，油酸丁酯的最高得率为82.2%。综上，本项目挖掘得到的几个真菌酯酶丰富了我国酯酶资源库，为酯酶的相关研究奠定了一定的基础；此外，酯酶的高表达量和良好的酶学性质，使其在合成风味酯、生物降解、生物能源等方面具有很大的工业应用潜力和价值。